ՌՆԹ-ն չի արդյունահանվում կամ ՌՆԹ-ի ելքը ցածր է

Հաճախ կան մի շարք գործոններ, որոնք ազդում են վերականգնման արդյունավետության վրա, ինչպիսիք են՝ հյուսվածքների նմուշի ՌՆԹ-ի պարունակությունը, գործողության եղանակը, լուծույթի ծավալը և այլն:

1. Գործողության ընթացքում կատարվել է սառցե լոգանք կամ կրիոգեն (4 °C) ցենտրիֆուգացիա:

Առաջարկություն. Աշխատեք սենյակային ջերմաստիճանում (15-25°C) ողջ գործընթացի ընթացքում, մի սառույցով լոգանք մի արեք և ցածր ջերմաստիճանում ցենտրիֆուգեք:

2. Նմուշի ոչ պատշաճ պահպանում կամ նմուշների պահպանման չափազանց մեծ ժամանակ:

Առաջարկություն. Նմուշները պահել -80 °C ջերմաստիճանում կամ սառեցնել հեղուկ ազոտի մեջ և խուսափել սառեցման և հալեցման կրկնակի օգտագործումից:փորձեք օգտագործել թարմ հյուսվածք կամ մշակված բջիջներ ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար:

3. Անբավարար նմուշի լիզ:

Առաջարկություն. Հյուսվածքը միատարրացնելիս համոզվեք, որ հյուսվածքը բավականաչափ համասեռացված է, և որ հյուսվածքային բջիջները բավականաչափ պառակտված են՝ բացատրելու ՌՆԹ-ի արտազատումը:

4. Էլյուենտը ճիշտ չի ավելացվել։

Առաջարկություն. Հաստատեք, որ RNase-Free ddH₂O-ն ավելացվում է կաթիլ-կաթիլային մաքրման սյունակի թաղանթի մեջտեղում:

5. Բացարձակ էթանոլի ճիշտ ծավալը չի ​​ավելացվել Buffer RL2-ին կամ Buffer RW2-ին:

Առաջարկություն. Հետևեք հրահանգներին, ավելացրեք բացարձակ էթանոլի ճիշտ ծավալը Buffer RL2 և Buffer RW2 և լավ խառնեք նախքան հավաքածուն օգտագործելը:

6. Հյուսվածքի նմուշի չափաբաժինը տեղին չէ:

Առաջարկություն. Օգտագործեք 10-20 մգ հյուսվածք կամ (1-5) × 10⁶բջիջները մեկ 500 μl բուֆերային RL1-ի համար, քանի որ հյուսվածքների չափազանց մեծ օգտագործումը կարող է հանգեցնել ՌՆԹ-ի արդյունահանման կրճատման:

7. Սխալ զտման ծավալը կամ թերի էլյուցիան:

Առաջարկություն. Մաքրման սյունակի արտանետման ծավալը 50-200 մկլ է;եթե էլյուցիոն էֆեկտը գոհացուցիչ չէ, խորհուրդ է տրվում երկարացնել սենյակային ջերմաստիճանի տեղադրման ժամանակը նախապես տաքացված RNase-Free ddH ավելացնելուց հետո:₂O, օրինակ՝ 5-10 րոպե:

8. Մաքրման սյունակն ունի էթանոլի մնացորդ բուֆերային RW2 լվացումից հետո:

Առաջարկություն. Եթե բուֆերային RW2 լվացումից հետո էթանոլի մնացորդ կա, դատարկ խողովակի ցենտրիֆուգումը 1 րոպեով, դատարկ խողովակի ցենտրիֆուգման գործողության ժամանակը կարող է ավելացվել մինչև 2 րոպե, կամ մաքրման սյունը կարող է տեղադրվել սենյակային ջերմաստիճանում 5 րոպե՝ մնացորդային էթանոլը պատշաճ կերպով հեռացնելու համար:

Մաքրված ՌՆԹ-ն քայքայվում է

Մաքրված ՌՆԹ-ի որակը կապված է այնպիսի գործոնների հետ, ինչպիսիք են նմուշի պահպանումը, RNase-ի աղտոտումը և մանիպուլյացիան և այլն:

1. Հյուսվածքների նմուշները ժամանակին չեն պահվում։

Առաջարկություն. Եթե հյուսվածքների նմուշները կամ բջիջները հավաքագրելուց հետո ժամանակին չեն օգտագործվում, անմիջապես կրիոպահպանեք -80 °C կամ հեղուկ ազոտով:ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար հնարավորության դեպքում օգտագործեք նոր վերցված հյուսվածք կամ բջիջ:

2. Հյուսվածքների նմուշների կրկնվող սառեցում-հալեցում:

Առաջարկություն. Հյուսվածքների նմուշները պահելու ժամանակ ավելի լավ է դրանք փոքր կտորների կտրել պահպանման համար, իսկ դրանց օգտագործման ժամանակ հեռացնել դրանցից մեկը՝ նմուշի կրկնվող սառեցումից-հալեցումից և ՌՆԹ-ի քայքայումից խուսափելու համար:

3. Վիրահատության ընթացքում RNase ներմուծված է կամ չկրելով միանգամյա օգտագործման ձեռնոցներ, դիմակներ և այլն:

Առաջարկություն. ՌՆԹ արդյունահանման փորձերը լավագույնս կատարվում են ՌՆԹ-ի մանիպուլյացիայի առանձին սենյակներում, և աղյուսակը մաքրվում է փորձից առաջ:

Փորձի ընթացքում կրեք միանգամյա օգտագործման ձեռնոցներ և դիմակներ, որպեսզի նվազագույնի հասցնեք ՌՆԹ-ի քայքայումը, որն առաջանում է RNase-ի ներդրմամբ:

4. Օգտագործման ընթացքում ռեակտիվները աղտոտվում են RNase-ով:

Առաջարկություն. Փոխարինեք նոր Կենդանիների ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածուով համապատասխան փորձերի համար:

5. ՌՆԹ մանիպուլյացիայի ժամանակ օգտագործվող ցենտրիֆուգային խողովակները, ծայրերը և այլն, աղտոտված են RNase-ով:

Առաջարկություն. Հաստատեք, որ ցենտրիֆուգային խողովակները, ծայրերը, պիպետները և այլն, որոնք օգտագործվում են ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար, բոլորը RNase-ից զերծ են:

Մաքրված ստացված ՌՆԹ-ն ազդում է ներքևում գտնվող փորձերի վրա

Մաքրման սյունակով մաքրված ՌՆԹ-ն, եթե աղի իոնները, սպիտակուցի պարունակությունը չափազանց մեծ է, կազդի ներքևի փորձի վրա, ինչպիսիք են՝ հակադարձ տառադարձումը, Հյուսիսային Բլոտ և այլն:

1. Էլյուացված ՌՆԹ-ն ունի աղի իոնների մնացորդներ:

Առաջարկություն. Հաստատեք, որ էթանոլի ճիշտ ծավալը ավելացվել է Buffer RW2-ին և կատարեք 2 մաքրման սյունակի լվացում շահագործման համար նշված կենտրոնախույս արագությամբ.եթե կա աղի իոնների մնացորդ, ապա մաքրման սյունը թողեք բուֆերային RW2 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում և կատարեք ցենտրիֆուգում՝ աղի աղտոտումը առավելագույնի հասցնելու համար:

2. Էթանոլի մնացորդը զտված ՌՆԹ-ում:

Առաջարկություն. Հաստատեք, որ RW2 բուֆերային լվացումից հետո կատարեք դատարկ խողովակի ցենտրիֆուգման գործողությունը շահագործման համար նշված ցենտրիֆուգման արագությամբ, ավելացրեք դատարկ խողովակի ցենտրիֆուգման գործողության ժամանակը մինչև 2 րոպե, եթե դեռ կա էթանոլի մնացորդ, կամ թողեք այն սենյակային ջերմաստիճանում 5 մ: