Իմ մտքում հայտնաբերման տեխնոլոգիայի պատմության մեջ մի քանի հեղափոխական գյուտեր են իմունային պիտակավորման տեխնոլոգիան, որը հիմնված է հակագեն-հակամարմին հատուկ կապի, PCR տեխնոլոգիայի և հաջորդականության տեխնոլոգիայի վրա:Այսօր մենք կխոսենք PCR տեխնոլոգիայի մասին:Համաձայն PCR տեխնոլոգիայի էվոլյուցիայի, մարդիկ սովորաբար բաժանում են PCR տեխնոլոգիան երեք սերունդների՝ սովորական PCR տեխնոլոգիա, իրական ժամանակի լյումինեսցենտ քանակական PCR տեխնոլոգիա և թվային PCR տեխնոլոգիա:
Cսովորական PCR տեխնիկա
ՔԱՐԻ ՄՈՒԼԼԻՍ (1944.12.28-2019.8.7)
Քերի Մալիսը հորինել է պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա, PCR) 1983 թվականին: Ասում են, որ երբ նա մեքենայով վարում էր իր ընկերուհուն, հանկարծակի ոգեշնչման բռնկվեց և մտածեց PCR սկզբունքի մասին (մեքենա վարելու առավելությունների մասին):Քերի Մալիսն արժանացել է քիմիայի Նոբելյան մրցանակի 1993 թվականին: The New York Times-ը մեկնաբանել է.
ՊՇՌ-ի սկզբունքը. ԴՆԹ պոլիմերազի կատալիզացման ներքո մայր շղթայի ԴՆԹ-ն օգտագործվում է որպես ձևանմուշ, իսկ հատուկ այբբենարանը՝ որպես ընդլայնման մեկնարկային կետ, իսկ մայր շղթայի ԴՆԹ-ին լրացնող դուստր ԴՆԹ-ն պատճենվում է in vitro՝ դենատուրացիայի, զտման, երկարացման և այլ քայլերի միջոցով:Սա ԴՆԹ-ի սինթեզի ուժեղացման տեխնոլոգիա է in vitro, որը կարող է արագ և հատուկ կերպով ուժեղացնել ցանկացած թիրախային ԴՆԹ in vitro:
Սովորական PCR-ի առավելությունները
1.Դասական մեթոդ, ամբողջական միջազգային և ներքին ստանդարտներ
2.Գործիքների ռեակտիվների ցածր արժեքը
3.PCR արտադրանքները կարող են վերականգնվել մոլեկուլային կենսաբանության այլ փորձերի համար
Առաջարկվող Foregene PCR մեքենա՝ https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Հարակից ապրանքներ՝ https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Սովորական PCR-ի թերությունները
1.հեշտ է աղտոտել
2.ծանր գործողություն
3.միայն որակական վերլուծություն
4.Չափավոր զգայունություն
5.Կա ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում, և երբ ոչ սպեցիֆիկ գոտին նույն չափն է, ինչ թիրախային գոտին, այն չի կարող տարբերվել
Cմեղրային էլեկտրոֆորեզի վրա հիմնված PCR
Ի պատասխան սովորական PCR-ի թերությունների, որոշ արտադրողներ ներկայացրել են գործիքներ, որոնք հիմնված են մազանոթային էլեկտրոֆորեզի սկզբունքի վրա:Էլեկտրոֆորեզի փուլը PCR ուժեղացումից հետո ավարտվում է մազանոթում:Զգայունությունը ավելի բարձր է, և մի քանի հիմքերի տարբերությունը կարելի է առանձնացնել և ուժեղացումը հաշվարկել MAERKER-ով։արտադրանքի բովանդակությունը.Թերությունն այն է, որ PCR արտադրանքը դեռ պետք է բացվի և դրվի գործիքի մեջ, և դեռ կա աղտոտման մեծ վտանգ:
CմեղրայինEէլեկտրոֆորեզ
2. Իրական ժամանակի լյումինեսցենտ քանակական PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) տեխնոլոգիաԼյումինեսցենտ քանակական PCR, որը նաև կոչվում է իրական ժամանակի PCR, նոր նուկլեինաթթվի քանակական տեխնոլոգիա է, որը մշակվել է PE-ի (Perkin Elmer) կողմից 1995 թվականին: Լյումինեսցենտ քանակական PCR-ի զարգացման պատմությունը այնպիսի հսկաների, ինչպիսիք են ABI, Roche և Bio-Rad-ը հոգեհարազատ պայքարի պատմություն է:Եթե դուք հետաքրքրված եք, կարող եք ստուգել այն:Այս տեխնիկան ներկայումս ամենահասուն և լայնորեն կիրառվող կիսաքանակական ՊՇՌ տեխնիկան է:
Առաջարկվող qPCR մեքենա՝ https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Լյումինեսցենտային ներկման մեթոդ (SYBR Green I):SYBR Green I-ն ամենից հաճախ օգտագործվող ԴՆԹ կապող ներկն է քանակական ՊՇՌ-ի համար, որը ոչ հատուկ կերպով կապվում է երկշղթա ԴՆԹ-ի հետ:Ազատ վիճակում SYBR Green-ն արտանետում է թույլ ֆլյուորեսցենտ, բայց երբ միանում է երկշղթա ԴՆԹ-ին, նրա ֆլյուորեսցենտությունը 1000 անգամ ավելանում է:Հետևաբար, ռեակցիայի կողմից արտանետվող լյումինեսցենտային ընդհանուր ազդանշանը համաչափ է առկա կրկնակի շղթա ԴՆԹ-ի քանակին և կավելանա ուժեղացված արտադրանքի ավելացման հետ:Քանի որ ներկը ոչ հատուկ կերպով կապվում է կրկնակի շղթա ունեցող ԴՆԹ-ի հետ, կարող են առաջանալ կեղծ դրական արդյունքներ:
Հարակից ապրանքներ՝ https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Լյումինեսցենտային զոնդի մեթոդ (Taqman տեխնոլոգիա) ընթացքումPCR ուժեղացում, հատուկ լյումինեսցենտային զոնդ ավելացվում է զույգ պրայմերների հետ միաժամանակ:Զոնդը գծային օլիգոնուկլեոտիդ է, որի երկու ծայրերում համապատասխանաբար պիտակավորված են լյումինեսցենտ հաղորդող խումբ և լյումինեսցենտ հանգցնող խումբ:Երբ զոնդն անձեռնմխելի է, լյումինեսցենտային ազդանշանը, որը թողարկվում է զեկուցող խմբի կողմից, կլանվում է հանգցնող խմբի կողմից, և հայտնաբերումը լյումինեսցենտային ազդանշան չկա.PCR ամպլիֆիկացիայի ժամանակ (ընդլայնման փուլում), Taq ֆերմենտի 5'-3' Dicer ակտիվությունը մարսելու և քայքայելու է զոնդը, այնպես, որ ռեպորտաժի լյումինեսցենտային խումբը և հանգցնող լյումինեսցենտային խումբը բաժանվում են, այնպես, որ ֆլյուորեսցենտային մոնիտորինգի համակարգը կարող է ստացվել, այսինքն, ամեն անգամ, երբ ստացվում է ամբողջական ԴՆԹ: լյումինեսցենտային ազդանշանների կուտակման և ՊՇՌ արտադրանքի ձևավորման համաժամացումը:Taqman զոնդի մեթոդը կլինիկական հայտնաբերման ամենատարածված հայտնաբերման մեթոդն է:
Հարակից ապրանքներ՝ https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
qPCR-ի առավելությունները
1.Մեթոդը հասուն է, և օժանդակ սարքավորումներն ու ռեակտիվները ամբողջական են
2.Ռեակտիվների միջին արժեքը
3.հեշտ է օգտագործել
4.Բարձր հայտնաբերման զգայունություն և առանձնահատկություն
qPCR-ի թերությունները
Թիրախային գենի մուտացիան հանգեցնում է բաց հայտնաբերման:
Ցածր կոնցենտրացիայի կաղապարի հայտնաբերման արդյունքը հնարավոր չէ որոշել:
Քանակական հայտնաբերման համար ստանդարտ կորի օգտագործման ժամանակ մեծ սխալ կա:
3. Digital PCR (digital PCR, dPCR) տեխնոլոգիա
Թվային PCR-ն նուկլեինաթթվի մոլեկուլների բացարձակ քանակական որոշման տեխնիկա է:Համեմատած qPCR-ի հետ՝ թվային ՊՇՌ-ն կարող է ուղղակիորեն կարդալ ԴՆԹ/ՌՆԹ մոլեկուլների թիվը, որը սկզբնական նմուշում նուկլեինաթթվի մոլեկուլների բացարձակ քանակությունն է:1999 թվականին Բերտ Ֆոգելշտեյնը և Քենեթ Վ. Կին-ցլերը պաշտոնապես առաջարկեցին dPCR-ի հայեցակարգը:
2006թ.-ին Fluidigm-ն առաջինն էր, որ արտադրեց առևտրային չիպերի վրա հիմնված dPCR գործիք:2009 թվականին Life Technologies-ը գործարկել է OpenArray և QuantStudio 12K Flex dPCR համակարգերը։2013 թվականին Life Technologies-ը գործարկել է QuantStudio 3DdPCR համակարգը, որն օգտագործում է բարձր խտության նանոմաշտաբով միկրոհեղուկ չիպային տեխնոլոգիա՝ նմուշները հավասարաչափ բաշխելու համար 20000 առանձին բջիջներում:ռեակցիայի մեջ լավ.
2011 թվականին Bio-Rad-ը թողարկեց կաթիլների վրա հիմնված QX100 dPCR գործիքը, որն օգտագործում է ջուրը յուղի տեխնոլոգիան՝ նմուշը հավասարաչափ բաշխելու համար 20,000 կաթիլ ջուր-յուղի մեջ, և օգտագործում է կաթիլային անալիզատոր՝ կաթիլները վերլուծելու համար:2012-ին RainDance-ը գործարկեց RainDrop dPCR գործիքը, որն աշխատում է բարձր ճնշման գազով, որպեսզի յուրաքանչյուր ստանդարտ ռեակցիայի համակարգը բաժանի ռեակցիայի էմուլսիայի, որը պարունակում է 1 միլիոնից մինչև 10 միլիոն պիկոլիտրի մակարդակի միկրոկաթիլներ:
Մինչ այժմ թվային PCR-ն ձևավորել է երկու հիմնական խմբակցություն՝ չիպի տեսակը և կաթիլային տեսակը:Անկախ նրանից, թե ինչպիսի թվային PCR է, դրա հիմնական սկզբունքներն են սահմանափակող նոսրացումը, վերջնական կետի PCR և Poisson բաշխումը:Նուկլեինաթթվի ձևանմուշներ պարունակող ստանդարտ PCR ռեակցիայի համակարգը հավասարապես բաժանված է տասնյակ հազարավոր PCR ռեակցիաների, որոնք բաշխվում են չիպսերի կամ միկրոկաթիլների վրա, այնպես որ յուրաքանչյուր ռեակցիա պարունակում է հնարավորինս շատ կաղապարային մոլեկուլ, և կատարվում է մեկ մոլեկուլային կաղապարի PCR ռեակցիա:Ֆլուորեսցենցիայի ընթերցմամբ հաշվում են ազդանշանի առկայությունը կամ բացակայությունը, և բացարձակ քանակականացումը կատարվում է վիճակագրական Պուասոնի բաշխման չափորոշումից հետո:
Ստորև բերված են իմ օգտագործած մի քանի թվային PCR հարթակների բնութագրերը.
1. Bio-Rad QX200 կաթիլային թվային PCR Bio-RadQX200-ը շատ դասական թվային PCR հարթակ է, հայտնաբերման հիմնական գործընթացը. 20,000 նմուշներ ստեղծվում են կաթիլների գեներատորի կողմից Ջուր-յուղի միկրո-կաթիլները ուժեղացվում են սովորական PCR մեքենայի վրա, և վերջապես յուրաքանչյուր միկրո-կաթիլների ֆլյուորեսցենտային ազդանշանը կարդում է միկրո-կաթիլների ընթերցողը:Գործողությունն ավելի բարդ է, իսկ աղտոտման վտանգը՝ միջին։
Xinyi TD1 միկրո-կաթիլային թվային PCRXinyi TD1-ը կենցաղային թվային PCR պլատֆորմ է, հայտնաբերման հիմնական գործընթացը. կաթիլների գեներատորի միջոցով ստեղծեք 30,000-50,000 ջուր յուղի մեջ կաթիլներ, ուժեղացնեք սովորական PCR գործիքի վրա և վերջապես փոխանցեք Կաթիլային ընթերցիչը կարդում է յուրաքանչյուր կաթիլի լյումինեսցենտային ազդանշանը:Ե՛վ կաթիլների արտադրությունը, և՛ ընթերցումը այս հարթակում կատարվում են հատուկ չիպի միջոցով՝ աղտոտման ցածր ռիսկով:
STILLA Naica միկրո-կաթիլային չիպ թվային PCRSTILLA Naica-ն համեմատաբար նոր թվային PCR հարթակ է:Հիմնական հայտնաբերման գործընթացն է՝ ավելացնել ռեակցիայի լուծույթը չիպի մեջ, չիպը դնել միկրո-կաթիլների առաջացման և ուժեղացման համակարգում և առաջացնել 30000 միկրոկաթիլ:Տարածեք չիպի վրա, և PCR ուժեղացումը ավարտվում է չիպի վրա:Այնուհետև ուժեղացված չիպը տեղափոխվում է միկրո-կաթիլների ընթերցման վերլուծության համակարգ, իսկ լյումինեսցենտային ազդանշանը ընթերցվում է՝ նկարներ անելով:Քանի որ ամբողջ գործընթացը տեղի է ունենում փակ չիպի մեջ, աղտոտման ռիսկը ցածր է:
4. ThermoFisher QuantStudio 3D չիպային թվային PCR
ThermoFisher QuantStudio 3D-ը դասական չիպի վրա հիմնված թվային PCR հարթակ է:Դրա հայտնաբերման հիմնական գործընթացն է՝ ավելացնել ռեակցիայի լուծույթը սփռիչի մեջ և ռեակցիայի լուծույթը հավասարաչափ տարածել չիպի վրա՝ 20000 միկրոհորերի միջոցով տարածիչի միջով:, չիպը դրեք PCR մեքենայի վրա՝ ուժեղացնելու համար, և վերջապես չիպը դրեք ընթերցողի մեջ և լուսանկարեք՝ լյումինեսցենտային ազդանշանը կարդալու համար:Գործողությունը համեմատաբար բարդ է, և ամբողջ գործընթացն իրականացվում է փակ չիպի մեջ, և աղտոտման ռիսկը ցածր է:
5. JN MEDSYS Clarity chip թվային PCR
JN MEDSYS Clarity-ն համեմատաբար նոր չիպի տիպի թվային PCR հարթակ է:Դրա հիմնական հայտնաբերման գործընթացն է՝ ավելացնել ռեակցիայի լուծույթը ապլիկատորի մեջ և ապլիկատորի միջոցով հավասարաչափ տարածել ռեակցիայի լուծույթը PCR խողովակի մեջ ամրացված 10000 PCR խողովակների վրա:Միկրոծակոտկեն չիպի վրա ռեակցիայի լուծույթը մազանոթային գործողության միջոցով մտնում է չիպ, և չիպի հետ PCR խողովակը տեղադրվում է PCR մեքենայի վրա ուժեղացման համար, և վերջապես չիպը դրվում է ընթերցողի մեջ՝ լուսանկարելով լյումինեսցենտային ազդանշանը կարդալու համար:Վիրահատությունն ավելի բարդ է.Աղտոտման վտանգը ցածր է:
Յուրաքանչյուր թվային PCR հարթակի պարամետրերը ամփոփված են հետևյալ կերպ.
Թվային PCR պլատֆորմի գնահատման ցուցանիշներն են՝ բաժանված միավորների քանակը, լյումինեսցենտային ալիքների քանակը, շահագործման բարդությունը և աղտոտման վտանգը:Բայց ամենակարևորը հայտնաբերման ճշգրտությունն է:Թվային PCR պլատֆորմները գնահատելու եղանակներից մեկը մի քանի թվային PCR հարթակների օգտագործումն է՝ միմյանց ստուգելու համար, և մեկ այլ եղանակ՝ ճշգրիտ արժեքներով ստանդարտ նյութերի օգտագործումը:
dPCR-ի առավելությունները
1.Բացարձակ քանակականացման հասնելը
2.Ավելի բարձր զգայունություն և առանձնահատկություն
3.Կարող է հայտնաբերել ցածր պատճենների նմուշներ
dPCR-ի թերությունները1. Թանկարժեք սարքավորումներ և ռեակտիվներ 2. Բարդ գործողություն և հայտնաբերման երկար ժամանակ 3. Նեղ հայտնաբերման տիրույթ
Ներկայումս PCR տեխնոլոգիայի երեք սերունդներն ունեն իրենց առավելություններն ու թերությունները, և յուրաքանչյուրն ունի իր կիրառական դաշտերը, և դա հարաբերություն չէ, որ մի սերունդը փոխարինի մյուսին:Տեխնոլոգիայի շարունակական առաջընթացը նոր կենսունակություն է ներարկել PCR տեխնոլոգիայի մեջ՝ հնարավորություն տալով դրան բացել կիրառման ուղղությունները մյուսի հետևից՝ դարձնելով նուկլեինաթթվի հայտնաբերումն ավելի հարմար և ճշգրիտ:
Աղբյուր. Դոկտոր Յուանը ձեզ տանում է թեստավորման
Առաջարկվող ապրանքներ.
Հրապարակման ժամանակը՝ նոյ-18-2022
