Մեկնարկային նյութ՝ ՌՆԹ
Քանակական հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR (RT-qPCR) փորձարարական մեթոդ է, որն օգտագործվում է ՊՇՌ-ի փորձերում՝ օգտագործելով ՌՆԹ-ն որպես սկզբնական նյութ:Այս մեթոդով ընդհանուր ՌՆԹ-ն կամ սուրհանդակային ՌՆԹ-ն (mRNA) նախ արտագրվում է կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ի (cDNA) հակադարձ տրանսկրիպտազի միջոցով:Այնուհետև, qPCR ռեակցիա է իրականացվել՝ օգտագործելով cDNA որպես ձևանմուշ:RT-qPCR-ն օգտագործվել է մոլեկուլային կենսաբանության մի շարք ծրագրերում, ներառյալ գեների արտահայտման վերլուծությունը, ՌՆԹ-ի միջամտության վավերացումը, միկրոզանգվածի վավերացումը, պաթոգենների հայտնաբերումը, գենետիկական փորձարկումը և հիվանդությունների հետազոտությունը:
Մեկ քայլ և երկքայլ մեթոդներ RT-qPCR-ի համար
RT-qPCR-ն կարող է իրականացվել մեկ կամ երկու քայլ մեթոդով:Մեկ քայլով RT-qPCR-ն համատեղում է հակադարձ տրանսկրիպցիան և ՊՇՌ ուժեղացումը, ինչը թույլ է տալիս հակադարձ տրանսկրիպտազին և ԴՆԹ պոլիմերազին ավարտել ռեակցիան նույն խողովակում նույն բուֆերային պայմաններում:Մեկ քայլով RT-qPCR-ն պահանջում է միայն հաջորդականության հատուկ պրայմերների օգտագործումը:Երկաստիճան RT-qPCR-ում հակադարձ տրանսկրիպցիան և ՊՇՌ ուժեղացումը կատարվում են երկու խողովակներում՝ օգտագործելով տարբեր օպտիմիզացված բուֆերներ, ռեակցիայի պայմաններ և պրայմերների նախագծման ռազմավարություններ:
| Առավելություն | Անբարենպաստություն | |
| Մեկ քայլ | Այս մեթոդն ունի ավելի քիչ փորձնական սխալ, քանի որ երկու ռեակցիաներն էլ կատարվում են մեկ խողովակում
Պիետտավորման ավելի քիչ քայլերը նվազեցնում են աղտոտման վտանգը
Հարմար է բարձր թողունակության ուժեղացման/զննման համար, արագ և վերարտադրելի | Երկաստիճան ռեակցիաները չեն կարող օպտիմիզացվել առանձին
Քանի որ ռեակցիայի պայմանները վտանգված են երկքայլ ռեակցիայի համադրմամբ, զգայունությունը այնքան լավ չէ, որքան երկքայլ մեթոդի զգայունությունը:
Մեկ նմուշով հայտնաբերված թիրախների թիվը փոքր է |
| Երկու քայլ | Կայուն cDNA գրադարաններ ստեղծելու ունակություն, որոնք կարող են պահպանվել երկար ժամանակ և օգտագործվել բազմաթիվ ռեակցիաներում
Թիրախային գեները և հղումային գեները կարող են ընդլայնվել նույն cDNA գրադարանից՝ առանց մի քանի cDNA գրադարանների անհրաժեշտության
Ռեակցիայի բուֆերներ և ռեակցիայի պայմաններ, որոնք թույլ են տալիս օպտիմիզացնել մեկ ռեակցիայի վազքները
ձգանման պայմանների ճկուն ընտրություն | Բազմաթիվ խողովակների և ավելի շատ խողովակաշարերի օգտագործումը մեծացնում է ԴՆԹ-ի աղտոտման վտանգը, և ժամանակատար:
Պահանջում է ավելի շատ օպտիմալացում, քան մեկ քայլ մեթոդը |
Առնչվող ապրանքներ.
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Մեկ քայլ)-SYBR Կանաչ I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Մեկ քայլ)-Taqman
RT Easyᵀᴹ I Master Premix for First Strand CDNA Synthesis
Իրական ժամանակում PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Իրական ժամանակում PCR Easyᵀᴹ-Taqman
Ընդհանուր ՌՆԹ-ի և mRNA-ի ընտրություն
RT-qPCR փորձը նախագծելիս կարևոր է որոշել՝ օգտագործել ընդհանուր ՌՆԹ, թե մաքրված mRNA, որպես հակադարձ տառադարձման ձևանմուշ:Չնայած mRNA-ն կարող է մի փոքր ավելի բարձր զգայունություն ապահովել, ընդհանուր ՌՆԹ-ն դեռ հաճախ օգտագործվում է:Սրա պատճառն այն է, որ ընդհանուր ՌՆԹ-ն որպես սկզբնական նյութ ավելի կարևոր առավելություն ունի, քան mRNA-ն։Նախ, գործընթացը պահանջում է ավելի քիչ մաքրման քայլեր, ինչը ապահովում է կաղապարի ավելի լավ քանակական վերականգնում և արդյունքների ավելի լավ նորմալացում դեպի սկզբնական բջիջների համարները:Երկրորդ, այն խուսափում է mRNA-ի հարստացման քայլից, որը կարող է խուսափել շեղված արդյունքների հնարավորությունից՝ տարբեր mRNA-ների տարբեր վերականգնման պատճառով:Ընդհանուր առմամբ, քանի որ շատ ծրագրերում թիրախ գենի հարաբերական քանակականացումը ավելի կարևոր է, քան հայտնաբերման բացարձակ զգայունությունը, ընդհանուր ՌՆԹ-ն շատ դեպքերում ավելի հարմար է:
Հակադարձ արտագրման այբբենարան
Երկքայլ մեթոդով cDNA-ի ռեակցիան սկսելու համար կարող են օգտագործվել երեք տարբեր մեթոդներ՝ օլիգո(dT) պրայմերներ, պատահական պրայմերներ կամ հաջորդականության հատուկ պրայմերներ:Որպես կանոն, օլիգո(dT) պրայմերները և պատահական պրայմերները օգտագործվում են համակցված:Այս այբբենարանները կռվում են կաղապարի mRNA շղթային և ապահովում են հակադարձ տրանսկրիպտազը՝ սինթեզի մեկնարկային կետով:
| Այբբենարանի ընտրություն | Կառուցվածք և գործառույթ | Առավելություն | Անբարենպաստություն |
| Օլիգո(dT) այբբենարան (կամ խարսխված օլիգո(dT) այբբենարան) | Ընդլայնված եռացում տիմինի մնացորդներին mRNA-ի պոլի(A) պոչում;խարիսխ օլիգո(dT) այբբենարանը պարունակում է G, C կամ A 3′ վերջում (խարիսխի տեղամաս) | Ամբողջական cDNA-ի սինթեզ պոլի(A) պոչավոր mRNA-ից
Կիրառելի է, երբ քիչ մեկնարկային նյութ կա
Խարիսխի տեղը ապահովում է, որ օլիգո(dT) այբբենարանը կապվում է mRNA-ի 5' պոլի(A) պոչին | Հարմար է միայն պոլի(A) պոչերով գեների ուժեղացման համար
Ստացեք cDNA կտրված պրիմինգի տեղամասից*2 poly(A)-ում
Կողմնակալված է կապվել 3′ վերջում*
*Այս հնարավորությունը նվազագույնի է հասցվում, եթե օգտագործվում են խարսխված օլիգո(dT) այբբենարաններ |
| պատահական այբբենարան
| 6-ից 9 հիմքեր երկարությամբ, որոնք կարող են միանալ բազմաթիվ տեղամասերի ՌՆԹ-ի տրանսկրիպցիայի ընթացքում | Կցվում է բոլոր ՌՆԹ-ներին (tRNA, rRNA և mRNA)
Հարմար է զգալի երկրորդական կառուցվածք ունեցող արտագրությունների համար, կամ երբ քիչ մեկնարկային նյութ կա
cDNA բարձր եկամտաբերություն | cDNA-ն հակադարձ արտագրվում է ամբողջ ՌՆԹ-ից, ինչը սովորաբար ցանկալի չէ և կարող է թուլացնել թիրախային mRNA-ի ազդանշանը:
ստանալ կտրված cDNA |
| հաջորդականության հատուկ այբբենարաններ | Հատուկ պրայմերներ, որոնք ուղղված են հատուկ mRNA հաջորդականություններին | հատուկ cDNA գրադարան
Բարելավել զգայունությունը
Օգտագործելով հակադարձ qPCR պրայմերներ | Սահմանափակվում է միայն մեկ թիրախային գենի սինթեզով |
Հակադարձ տրանսկրիպտազ
Հակադարձ տրանսկրիպտազը ֆերմենտ է, որն օգտագործում է ՌՆԹ՝ ԴՆԹ սինթեզելու համար։Որոշ հակադարձ տրանսկրիպտազներ ունեն RNase ակտիվություն և տրանսկրիպցիայից հետո կարող են քայքայել ՌՆԹ-ի շղթաները ՌՆԹ-ԴՆԹ հիբրիդային շղթաներում:Եթե այն չունի RNase ֆերմենտային ակտիվություն, RNaseH-ը կարող է ավելացվել qPCR-ի ավելի բարձր արդյունավետության համար:Սովորաբար օգտագործվող ֆերմենտները ներառում են Moloney մկների լեյկոզ վիրուսի հակադարձ տրանսկրիպտազը և թռչնի միելոբլաստոմա վիրուսի հակադարձ տրանսկրիպտազը:RT-qPCR-ի համար իդեալական է ընտրել հակադարձ տրանսկրիպտազ՝ ավելի բարձր ջերմակայունությամբ, որպեսզի cDNA-ի սինթեզը հնարավոր լինի կատարել ավելի բարձր ջերմաստիճաններում՝ ապահովելով ավելի բարձր երկրորդային կառուցվածքով ՌՆԹ-ների հաջող տրանսկրիպցիան՝ միաժամանակ պահպանելով դրանց լիարժեք ակտիվությունը ողջ ռեակցիայի ընթացքում՝ հանգեցնելով cDNA-ի բարձր ելքի:
Առնչվող ապրանքներ.
Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase
Հակադարձ տրանսկրիպտազի RNase H ակտիվությունը
RNaseH-ն ի վիճակի է քայքայել ՌՆԹ-ի շղթաները ՌՆԹ-ԴՆԹ դուպլեքսներից՝ թույլ տալով երկշղթա ԴՆԹ-ի արդյունավետ սինթեզ:Այնուամենայնիվ, երկար mRNA-ն որպես ձևանմուշ օգտագործելիս ՌՆԹ-ն կարող է վաղաժամ քայքայվել, ինչի արդյունքում cDNA-ն կտրված է:Հետևաբար, հաճախ ձեռնտու է նվազագույնի հասցնել RNaseH-ի ակտիվությունը cDNA-ի կլոնավորման ժամանակ, եթե երկար տառադարձումների սինթեզը ցանկալի է:Ի հակադրություն, RNase H-ի ակտիվությամբ հակադարձ տրանսկրիպտազները հաճախ օգտակար են qPCR-ի կիրառման համար, քանի որ դրանք ուժեղացնում են ՌՆԹ-ԴՆԹ-ի դուպլեքսների հալեցումը ՊՇՌ-ի առաջին ցիկլի ընթացքում:
Այբբենարանի ձևավորում
RT-qPCR-ում qPCR քայլի համար օգտագործվող PCR այբբենարանները պետք է իդեալականորեն նախագծված լինեն էկզոն-էկզոն միացումն ընդարձակելու համար, որտեղ ուժեղացման այբբենարանը կարող է ներթափանցել իրական էկզոն-ինտրոն սահմանի վրա:Քանի որ ինտրոն պարունակող գենոմային ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները ուժեղացված չեն, այս դիզայնը նվազեցնում է գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտման արդյունքում ուժեղացված կեղծ պոզիտիվների ռիսկը:
Եթե պրայմերները չեն կարող նախագծվել էկզոնների կամ էկզոն-էկզոնների սահմանները բաժանելու համար, կարող է անհրաժեշտ լինել ՌՆԹ-ի նմուշները մշակել RNase-ից զերծ DNase I-ով կամ dsDNase-ով՝ գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը հեռացնելու համար:
RT-qPCR հսկողություն
Հակադարձ արտագրման բացասական հսկողություն (-RT հսկողություն) պետք է ներառվի RT-qPCR բոլոր փորձերում՝ ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը հայտնաբերելու համար (օրինակ՝ գենոմային ԴՆԹ կամ PCR արտադրանքները նախորդ ռեակցիաներից):Այս հսկողությունը պարունակում է ռեակցիայի բոլոր բաղադրիչները, բացառությամբ հակադարձ տրանսկրիպտազի:Քանի որ հակադարձ տրանսկրիպցիան չի կատարվում այս հսկողության դեպքում, եթե նկատվում է PCR ուժեղացում, ապա ամենայն հավանականությամբ ԴՆԹ-ից աղտոտվածություն կա:
Հրապարակման ժամանակը՝ օգ-02-2022
