• PCR-ն մեթոդ է, որն օգտագործվում է ԴՆԹ-ի փոքր քանակության կաղապարից ԴՆԹ-ի ուժեղացման համար:RT-PCR-ն օգտագործում է հակադարձ տառադարձում ՌՆԹ-ի աղբյուրից ԴՆԹ-ի ձևանմուշ արտադրելու համար, որն այնուհետև կարող է ուժեղացվել:
• PCR-ը և RT-PCR-ը սովորաբար վերջնակետային ռեակցիաներ են, մինչդեռ qPCR-ն և RT-qPCR-ն օգտագործում են արտադրանքի սինթեզի արագության կինետիկան PCR ռեակցիայի ժամանակ՝ քանակականացնելու համար առկա կաղապարի քանակը:
• Ավելի նոր մեթոդները, ինչպիսիք են թվային ՊՇՌ-ն, ապահովում են նախնական ԴՆԹ-ի կաղապարի բացարձակ քանակությունը, մինչդեռ այնպիսի մեթոդներ, ինչպիսին է իզոթերմային ՊՇՌ-ն, նվազեցնում են թանկարժեք սարքավորումների կարիքը՝ հուսալի արդյունքներ ապահովելու համար:

Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) համեմատաբար պարզ և լայնորեն կիրառվող մոլեկուլային կենսաբանության մեթոդ է՝ ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի հաջորդականությունների ուժեղացման և հայտնաբերման համար:ԴՆԹ-ի կլոնավորման և ուժեղացման ավանդական մեթոդների համեմատ, որոնք հաճախ կարող են տևել օրեր, ՊՇՌ-ն պահանջում է ընդամենը մի քանի ժամ:PCR-ը շատ զգայուն է և պահանջում է նվազագույն ձևանմուշ հատուկ հաջորդականությունների հայտնաբերման և ուժեղացման համար:ՊՇՌ-ի հիմնական մեթոդներն ավելի առաջադիմել են պարզ ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի հայտնաբերումից:Ստորև մենք տրամադրել ենք PCR տարբեր մեթոդների և ռեակտիվների ակնարկ, որոնք մենք տրամադրում ենք Enzo Life Sciences-ում ձեր հետազոտական ​​կարիքների համար:Մենք նպատակ ունենք օգնել գիտնականներին արագ մուտք գործել PCR ռեագենտներ՝ օգտագործելու իրենց հաջորդ հետազոտական ​​նախագծում:

ՊՇՌ

Ստանդարտ ՊՇՌ-ի համար ձեզ հարկավոր է միայն ԴՆԹ պոլիմերազ, մագնեզիում, նուկլեոտիդներ, պրայմերներ, ուժեղացվող ԴՆԹ ձևանմուշ և ջերմոցիկացնող սարք:ՊՇՌ մեխանիզմը նույնքան պարզ է, որքան դրա նպատակը. 1) երկշղթա ԴՆԹ (dsDNA) ջերմային դենատուրացված է, 2) պրայմերները համընկնում են ԴՆԹ-ի առանձին շղթաների հետ, և 3) այբբենարանները երկարացվում են ԴՆԹ պոլիմերազով, ինչի արդյունքում ստացվում է ԴՆԹ-ի երկու օրինակ: բնօրինակ ԴՆԹ շղթա:Դենատուրացիայի, կռման և երկարացման գործընթացը մի շարք ջերմաստիճանների և ժամանակների ընթացքում հայտնի է որպես ուժեղացման մեկ ցիկլ (նկ. 1):

Ցիկլի յուրաքանչյուր քայլ պետք է օպտիմիզացված լինի օգտագործված կաղապարի և այբբենարանի համար:Այս ցիկլը կրկնվում է մոտավորապես 20-40 անգամ, և ուժեղացված արտադրանքը կարող է այնուհետև վերլուծվել, սովորաբար ագարոզայի գելով (նկ. 2):

Քանի որ ՊՇՌ-ն շատ զգայուն մեթոդ է և շատ փոքր ծավալներ են պահանջվում առանձին ռեակցիաների համար, խորհուրդ է տրվում մի քանի ռեակցիաների համար հիմնական խառնուրդ պատրաստել:Հիմնական խառնուրդը պետք է լավ խառնվի, այնուհետև բաժանվի ըստ ռեակցիաների քանակի՝ ապահովելով, որ յուրաքանչյուր ռեակցիա կպարունակի նույն քանակությամբ ֆերմենտներ, dNTPs և պրայմերներ:Շատ մատակարարներ, ինչպիսիք են Enzo Life Sciences-ը, առաջարկում են նաև PCR խառնուրդներ, որոնք արդեն պարունակում են ամեն ինչ, բացի պրայմերներից և ԴՆԹ կաղապարից:

Գուանին/Ցիտոզինով հարուստ (GC-ով հարուստ) շրջանները մարտահրավեր են ստանդարտ ՊՇՌ տեխնիկայում:GC-ով հարուստ հաջորդականությունները ավելի կայուն են, քան GC-ի ավելի ցածր պարունակությամբ հաջորդականությունները:Ավելին, GC-ով հարուստ հաջորդականությունները հակված են ձևավորելու երկրորդական կառուցվածքներ, ինչպիսիք են վարսահարդարման օղակները:Արդյունքում, GC-ով հարուստ կրկնակի շղթաները դժվար է ամբողջությամբ բաժանվել դենատուրացիայի փուլում:Հետևաբար, ԴՆԹ պոլիմերազը չի կարող առանց խոչընդոտի սինթեզել նոր շղթան:Դենատուրացիայի ավելի բարձր ջերմաստիճանը կարող է բարելավել դա, իսկ եռացման ավելի բարձր ջերմաստիճանի և ավելի կարճ եռացման ժամանակի ճշգրտումները կարող են կանխել GC-ով հարուստ այբբենարանների ոչ հատուկ կապակցումը:Լրացուցիչ ռեակտիվները կարող են ուժեղացնել GC-ով հարուստ հաջորդականությունների ուժեղացումը:DMSO-ն, գլիցերինը և բետաինը օգնում են խաթարել GC-ի փոխազդեցությունների հետևանքով առաջացած երկրորդական կառուցվածքները և դրանով իսկ հեշտացնել կրկնակի շղթաների բաժանումը:

Hot Start PCR

Անհատուկ ուժեղացումը խնդիր է, որը կարող է առաջանալ PCR-ի ժամանակ:ԴՆԹ պոլիմերազների մեծ մասը, որոնք օգտագործվում են PCR-ի համար, լավագույնս աշխատում են 68°C-ից մինչև 72°C ջերմաստիճաններում:Այնուամենայնիվ, ֆերմենտը կարող է ակտիվ լինել նաև ցածր ջերմաստիճանի դեպքում, թեև ավելի ցածր աստիճանի:Եռման ջերմաստիճանից շատ ցածր ջերմաստիճաններում պրայմերները կարող են կապվել ոչ հատուկ և հանգեցնել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման, նույնիսկ եթե ռեակցիան ստեղծվել է սառույցի վրա:Դա կարելի է կանխել՝ օգտագործելով պոլիմերազային ինհիբիտորներ, որոնք տարանջատվում են ԴՆԹ պոլիմերազից միայն որոշակի ջերմաստիճանի հասնելուց հետո, հետևաբար կոչվում է տաք մեկնարկ PCR:Ինհիբիտորը կարող է լինել հակամարմին, որը կապում է պոլիմերազին և դենատուրացիա է անում սկզբնական դենատուրացիայի ջերմաստիճանում (սովորաբար 95°C):

Բարձր հավատարմության պոլիմերազա

Թեև ԴՆԹ պոլիմերազները բավականին ճշգրիտ կերպով ուժեղանում են սկզբնական կաղապարի հաջորդականության հետ, կարող են տեղի ունենալ նուկլեոտիդների համապատասխանության սխալներ:Ծրագրերի անհամապատասխանությունները, ինչպիսին է կլոնավորումը, կարող են հանգեցնել կրճատված տառադարձումների և սխալ թարգմանված կամ անգործուն սպիտակուցների:Այս անհամապատասխանություններից խուսափելու համար «սրբագրող» ակտիվությամբ պոլիմերազներ են հայտնաբերվել և ներառվել աշխատանքային գործընթացում:Առաջին սրբագրող պոլիմերազը՝ Pfu-ն, հայտնաբերվել է 1991 թվականին Pyrococcus furiosus-ում:Այս Pfu ֆերմենտը ունի 3'-ից 5' էկզոնուկլեազային ակտիվություն:Քանի որ ԴՆԹ-ն ուժեղանում է, էկզոնուկլեազը հեռացնում է շղթայի 3' ծայրի անհամապատասխան նուկլեոտիդները:Այնուհետև փոխարինվում է ճիշտ նուկլեոտիդը, և ԴՆԹ-ի սինթեզը շարունակվում է:Սխալ նուկլեոտիդային հաջորդականությունների նույնականացումը հիմնված է ֆերմենտի հետ ճիշտ նուկլեոզիդ տրիֆոսֆատի հետ կապված կապի վրա, որտեղ անարդյունավետ կապը դանդաղեցնում է սինթեզը և թույլ է տալիս ճիշտ փոխարինել:Pfu պոլիմերազի սրբագրման ակտիվությունը հանգեցնում է ավելի քիչ սխալների վերջնական հաջորդականության մեջ՝ համեմատած Taq ԴՆԹ պոլիմերազի հետ:Վերջին տարիներին հայտնաբերվել են սրբագրման այլ ֆերմենտներ, և սկզբնական Pfu ֆերմենտի փոփոխություններ են կատարվել՝ ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի ժամանակ սխալի մակարդակը ավելի նվազեցնելու համար:

RT-PCR

Reverse transcription PCR կամ RT-PCR-ն թույլ է տալիս օգտագործել ՌՆԹ-ն որպես ձևանմուշ:Լրացուցիչ քայլը թույլ է տալիս հայտնաբերել և ուժեղացնել ՌՆԹ-ն:ՌՆԹ-ն հակադարձ տառադարձվում է կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ի (cDNA)՝ օգտագործելով հակադարձ տրանսկրիպտազ:ՌՆԹ կաղապարի որակն ու մաքրությունը էական նշանակություն ունեն RT-PCR-ի հաջողության համար:RT-PCR-ի առաջին քայլը ԴՆԹ/ՌՆԹ հիբրիդի սինթեզն է:Հակադարձ տրանսկրիպտազն ունի նաև RNase H ֆունկցիա, որը քայքայում է հիբրիդի ՌՆԹ-ի մասը:Այնուհետև միաշղթա ԴՆԹ-ի մոլեկուլը լրացվում է հակադարձ տրանսկրիպտազի ԴՆԹ-ից կախված ԴՆԹ պոլիմերազային ակտիվությամբ դեպի cDNA:Առաջին շղթայի ռեակցիայի արդյունավետությունը կարող է ազդել ուժեղացման գործընթացի վրա:Այսուհետ ստանդարտ PCR պրոցեդուրան օգտագործվում է cDNA-ն ուժեղացնելու համար:ՌՆԹ-ն cDNA-ի RT-PCR-ով վերադարձնելու հնարավորությունը շատ առավելություններ ունի, և այն հիմնականում օգտագործվում է գեների արտահայտման վերլուծության համար:ՌՆԹ-ն միաշղթա է և շատ անկայուն, ինչը դժվարացնում է դրա հետ աշխատելը:Այն սովորաբար ծառայում է որպես qPCR-ի առաջին քայլ, որը քանակականացնում է ՌՆԹ-ի տառադարձումները կենսաբանական նմուշում:

qPCR և RT-qPCR

Քանակական PCR (qPCR) օգտագործվում է նուկլեինաթթուները հայտնաբերելու, բնութագրելու և քանակականացնելու համար բազմաթիվ կիրառություններում:RT-qPCR-ում ՌՆԹ-ի տրանսկրիպտները հաճախ քանակականացվում են՝ սկզբում դրանք հակադարձ արտագրելով cDNA-ի մեջ, ինչպես նկարագրված է վերևում, և այնուհետև իրականացվում է qPCR:Ինչպես ստանդարտ PCR-ում, ԴՆԹ-ն ուժեղացվում է երեք կրկնվող քայլերով` դենատուրացիա, կռում և երկարացում:Այնուամենայնիվ, qPCR-ում լյումինեսցենտային պիտակավորումը հնարավորություն է տալիս տվյալների հավաքագրում PCR-ի առաջընթացի ընթացքում:Այս տեխնիկան ունի բազմաթիվ առավելություններ՝ շնորհիվ առկա մեթոդների և քիմիայի:

Ներկերի վրա հիմնված qPCR-ում (սովորաբար կանաչ), լյումինեսցենտային պիտակավորումը թույլ է տալիս քանակականացնել ուժեղացված ԴՆԹ-ի մոլեկուլները՝ օգտագործելով dsDNA կապող ներկ:Յուրաքանչյուր ցիկլի ընթացքում չափվում է լյումինեսցենտությունը:Ֆլյուորեսցենտային ազդանշանը համամասնորեն մեծանում է կրկնվող ԴՆԹ-ի քանակին:Հետևաբար, ԴՆԹ-ն քանակականացվում է «իրական ժամանակում» (նկ. 3):Ներկանյութի վրա հիմնված qPCR-ի թերություններն այն են, որ միաժամանակ կարող է հետազոտվել միայն մեկ թիրախ, և որ ներկը կապվելու է նմուշում առկա ցանկացած ds-DNA-ի հետ:

Զոնդի վրա հիմնված qPCR-ում յուրաքանչյուր նմուշում կարող են միաժամանակ հայտնաբերվել բազմաթիվ թիրախներ, սակայն դա պահանջում է թիրախին հատուկ զոնդ(ներ)ի օպտիմալացում և նախագծում, որն օգտագործվում է բացի պրայմերներից:Հասանելի են զոնդի նախագծման մի քանի տեսակներ, բայց ամենատարածված տեսակը հիդրոլիզի զոնդն է, որը ներառում է ֆտորոֆոր և մարող:Ֆլյուորեսցենտային ռեզոնանսային էներգիայի փոխանցումը (FRET) կանխում է ֆտորոֆորի արտանետումը հանգցիչի միջոցով, մինչդեռ զոնդն անփոփոխ է:Այնուամենայնիվ, PCR ռեակցիայի ժամանակ զոնդը հիդրոլիզվում է այբբենարանի երկարացման և հատուկ հաջորդականության ուժեղացման ժամանակ, որին այն կապված է:Զոնդի ճեղքը բաժանում է ֆտորոֆորը հանգցնողից և հանգեցնում է ֆլյուորեսցենցիայի ուժեղացումից կախված աճին (նկ. 4):Այսպիսով, զոնդի վրա հիմնված qPCR ռեակցիայի ֆլուորեսցենտային ազդանշանը համաչափ է նմուշում առկա զոնդի թիրախային հաջորդականության քանակին:Քանի որ զոնդի վրա հիմնված qPCR-ն ավելի սպեցիֆիկ է, քան ներկերի վրա հիմնված qPCR-ն, դա հաճախ այն տեխնոլոգիան է, որն օգտագործվում է qPCR-ի վրա հիմնված ախտորոշիչ փորձարկումներում:

Իզոթերմային ուժեղացում

Վերոհիշյալ PCR տեխնիկան պահանջում է թանկարժեք ջերմոցիկացման սարքավորում՝ խցիկի ջերմաստիճանը ճշգրիտ բարձրացնելու և իջեցնելու համար դենատուրացիայի, եռացման և երկարացման քայլերի համար:Մշակվել են մի շարք տեխնիկա, որոնք նման ճշգրիտ սարքերի կարիք չունեն և կարող են իրականացվել պարզ ջրային բաղնիքում կամ նույնիսկ հետաքրքրության բջիջների ներսում:Այս տեխնիկան ընդհանուր առմամբ կոչվում է իզոթերմային ուժեղացում և աշխատում է էքսպոնենցիալ, գծային կամ կասկադային ուժեղացման վրա:

Իզոթերմային ուժեղացման ամենահայտնի տեսակը օղակով միջնորդավորված իզոթերմային ուժեղացումն է կամ LAMP:LAMP-ն օգտագործում է էքսպոնենցիալ ուժեղացում 65⁰C ջերմաստիճանում՝ ձևանմուշի ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն ուժեղացնելու համար:LAMP-ն իրականացնելիս թիրախ ԴՆԹ-ի շրջաններին լրացնող չորսից վեց պրայմերներ օգտագործվում են ԴՆԹ պոլիմերազի հետ՝ նոր ԴՆԹ սինթեզելու համար:Այս այբբենարաններից երկուսն ունեն հավելյալ հաջորդականություններ, որոնք ճանաչում են մյուս այբբենարանների հաջորդականությունը և կապում դրանք՝ թույլ տալով, որ նոր սինթեզված ԴՆԹ-ում ձևավորվի «օղակ» կառուցվածք, որն այնուհետև նպաստում է այբբենարանի եռացմանը ուժեղացման հաջորդ փուլերում:LAMP-ը կարելի է պատկերացնել մի քանի մեթոդներով, ներառյալ ֆլուորեսցենտը, ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզը կամ գունաչափությունը:Գունաչափության միջոցով արտադրանքի առկայությունը կամ բացակայությունը վիզուալացնելու և հայտնաբերելու հեշտությունը և պահանջվող թանկարժեք սարքավորումների բացակայությունը LAMP-ը դարձրեցին հարմար տարբերակ SARS-CoV-2 թեստավորման համար այն տարածքներում, որտեղ կլինիկական լաբորատոր թեստավորումն անհասանելի էր, կամ նմուշների պահեստավորում և տեղափոխում: անիրագործելի էր, կամ լաբորատորիաներում, որոնք նախկինում չունեին PCR ջերմոցիկացման սարքավորում: