ՊՇՌ ռեակտիվների վաղ փուլում պրայմերների և զոնդերի աշխատանքի ստուգումը և ռեակցիայի ամենահարմար պայմանների որոշումը նախադրյալներն են պաշտոնական փորձերի սահուն առաջընթացն ապահովելու համար:
Այսպիսով, ինչպե՞ս պետք է հաստատենք այբբենարանի զոնդը վաղ փուլում:
Հիմնական ցուցանիշներն են՝ բազային, ուժեղացման կորը, ct արժեքը, ուժեղացման արդյունավետությունը, ցածր կոնցենտրացիայի նմուշի հայտնաբերումը, CV և այլն։
Ելակետ
Բազային գիծը PCR ուժեղացման կորի հորիզոնական գիծն է:PCR ուժեղացման ռեակցիայի առաջին մի քանի ցիկլերում ֆլյուորեսցենտային ազդանշանը շատ չի փոխվում և ուղիղ գիծ է կազմում:Այս ուղիղ գիծը հիմքն է:
PCR այբբենարանի զոնդերը զննելու ժամանակ ուշադրություն դարձրեք, թե արդյոք բազային գիծը հարթ է:Պրայմերային զոնդի կոնցենտրացիայի մաքրությունը կազդի ելակետային գծի վրա, ինչպես օրինակ՝ առաջացնելով բազային գծի բարձրացում կամ անկում:Հիմնական գիծը նույնպես շատ ինտուիտիվ ցուցանիշ է:
Ուժեղացման կոր
Մեկ այլ ինտուիտիվ ցուցանիշ է ուժեղացման կորի ձևը:Լավագույնն այն է, որ լինի S-աձև կոր՝ երկրորդական ուժեղացումից կամ ուժեղացման այլ աննորմալ կորերից խուսափելու համար:
Ct արժեքը
Բազային գծից մինչև էքսպոնենցիալ աճի շեղման կետին համապատասխանող ցիկլերի քանակը Ct արժեքն է:
Նույն նմուշի համար տարբեր այբբենարանների զոնդերը հանգեցնում են ուժեղացման տարբեր կորերի, և համապատասխան Ct արժեքը կազդի ուժեղացման արդյունավետության և միջամտության աստիճանի վրա:Տեսականորեն, որքան փոքր է մեր ընտրած այբբենարանի զոնդի Ct արժեքը, այնքան լավ:
Ուժեղացման արդյունավետություն
PCR ուժեղացման արդյունավետության գնահատման ամենահուսալի և կայուն մեթոդներից մեկը ստանդարտ կորն է, որը նույնպես լայնորեն ճանաչված է հետազոտողների կողմից:Մեթոդը ներառում է մի շարք նմուշների պատրաստում՝ նպատակային կաղապարների հարաբերական թիվը վերահսկելու համար:Այս նմուշները սովորաբար պատրաստվում են խտացված լուծույթների սերիական նոսրացումներով, ամենից հաճախ օգտագործվում է 10 անգամ նոսրացումը:Օգտագործելով մի շարք նոսրացված նմուշներ, օգտագործելով ստանդարտ qPCR ծրագիրը՝ ուժեղացնելու համար Cq արժեքը ստանալու համար, և վերջապես գծեք ստանդարտ կոր՝ ըստ յուրաքանչյուր նմուշի կոնցենտրացիայի և համապատասխան Cq արժեքի՝ ստանալով Cq= -klgX0+b գծային հավասարումը և ուժեղացման արդյունավետությունը E=10(-1 /k)-1:Քանակական վերլուծության համար qPCR օգտագործելիս ուժեղացման արդյունավետությունը պահանջվում է 90%-110% (3.6>k>3.1) սահմաններում:
Ցածր կոնցենտրացիայի նմուշների հայտնաբերում
Երբ նմուշի կոնցենտրացիան ցածր է, տարբեր այբբենարանների հայտնաբերման արագությունները տարբեր են:Մենք ընտրում ենք 20 ցածր կոնցենտրացիայի նմուշներ՝ կրկնօրինակելու համար, և ամենաբարձր հայտնաբերման արագությամբ այբբենարան-զոնդ համակարգը լավագույնն է:
Տատանումների գործակից (CV)
10 կրկնօրինակ նմուշներ կարող են հայտնաբերվել տարբեր պրայմերային զոնդերով՝ համաձայն ռեագենտի գծային ստանդարտի՝ նուկլեինաթթվի ուժեղացման հայտնաբերման համար:
Քանակական ռեակտիվներ.
Ճշգրտություն
Մեկ խմբաքանակի ճշգրտությունը պետք է համապատասխանի. փորձարկման կոնցենտրացիայի լոգարիթմական արժեքի տատանումների գործակիցը (CV,%) ≤5% է:Երբ նմուշի կոնցենտրացիան ցածր է, հայտնաբերման կոնցենտրացիայի լոգարիթմի փոփոխության գործակիցը (CV,%) ≤10% է:
Որակական ռեակտիվներ.
Ճշգրտություն
Մեկ խմբաքանակի ճշգրտությունը պետք է համապատասխանի.
(1) Ct արժեքի տատանումների գործակիցը (CV,%) ≤5%
Նույն նմուշը զուգահեռաբար փորձարկվում է 10 անգամ, և թեստի արդյունքները պետք է համապատասխանեն
Հրապարակման ժամանակը՝ սեպտ-18-2021
