Ես հավատում եմ, որ բոլորը միշտ կհանդիպեն այս կամ այն ​​խնդիրների PCR ռեակցիաներ կատարելիս, բայց դրանցից շատերը կարելի է դասակարգել երկու հիմնական խնդիրների.

Գենի ձևանմուշի չափազանց քիչ ուժեղացում (ուժեղացում);
Չափից շատ ոչ նպատակային գենի ուժեղացում:
Հավելանյութերի օգտագործումը այս խնդիրների լուծման ընդհանուր ռազմավարություններից մեկն է:Սովորաբար հավելումների դերն ունի երկու ասպեկտ.
երկրորդական կառուցվածքըգեների (երկրորդային կառուցվածքի);
Նվազեցրեք ոչ հատուկ պրիմինգը:
Այսօր խմբագիրը հակիրճ կներկայացնի ձեզ ՊՇՌ ռեակցիաներում տարածված հավելումները և դրանց գործառույթները:
Հավելումներ, որոնք նվազեցնում են երկրորդական կառուցվածքը
սուլֆօքսիդ(DMSO)
գենի նմուշներբարձր GC պարունակությամբ:Այնուամենայնիվ, DMSO-ն նաև մեծապես նվազեցնում է Taq պոլիմերազային ակտիվությունը:Հետևաբար, բոլորը պետք է հավասարակշռեն ձևանմուշի հասանելիությունը և պոլիմերազի ակտիվությունը:Խմբագիրն առաջարկում է, որ դուք կարող եք փորձել DSMO-ի տարբեր կոնցենտրացիաներ, օրինակ՝ 2%-ից մինչև 10%, որպեսզի գտնեք այն կոնցենտրացիան, որը համապատասխանում է ձեր փորձին:
Ոչ իոնային լվացող միջոցներ
Ոչ իոնային լվացող միջոցները, ինչպիսիք են 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 կամ NP-40, սովորաբար նվազեցնում են ԴՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը:Թեև դա կարող է մեծացնել կաղապարի գենի ուժեղացումը, այն նաև կհանգեցնի ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման դժվարություններին:Այսպիսով, այս հավելումները լավ են աշխատում ցածր եկամտաբերության PCR ռեակցիաների համար, առանց բեկորների, բայց ոչ այնքան լավ PRC-ի համեմատաբար անմաքուր ռեակցիաների համար:Ոչ իոնային լվացող միջոցների մեկ այլ առավելություն SDS աղտոտվածության նվազեցումն է:Սովորաբար ԴՆԹ-ի արդյունահանման գործընթացում SDS-ը բերվում է ՊՇՌ-ի փուլին, որը մեծապես արգելակում է պոլիմերազի ակտիվությունը:Հետևաբար, ռեակցիային 0,5% Tween-20 կամ Tween-40 ավելացնելը կարող է չեզոքացնել SDS-ի բացասական ազդեցությունը:
Բետայն_
Բետայնը կարող է բարելավել ԴՆԹ-ի ուժեղացումը՝ նվազեցնելով երկրորդական կառուցվածքի ձևավորումը և, ընդհանուր առմամբ, «առեղծվածային» հավելում է առևտրային PCR փաթեթներին:Եթե ​​ցանկանում եք օգտագործել բետաին, դուք պետք է դնեք բետաին կամ բետաին մոնոհիդրատ (բետաին կամ բետաին մոնոհիդրատ), բայց ոչ բետաին հիդրոքլորիդ (բետաին HCl), հարմարեցրեք վերջնական կոնցենտրացիան 1-1,7 մ.Բետայնը կարող է նաև օգնել բարելավելու յուրահատկությունը, քանի որ այն վերացնում է ԴՆԹ-ի հալման/ԴՆԹ-ի դենատուրացիայի բազային զույգ կազմի կախվածությունը:
Հավելումներ՝ ոչ հատուկ պրիմինգը նվազեցնելու համար
Ֆորմամիդ
Formamide-ը սովորաբար օգտագործվող օրգանական PCR հավելում է:Այն կարող է միավորվել ԴՆԹ-ի հիմնական և փոքր ակոսների հետ՝ դրանով իսկ նվազեցնելով հիմնական ԴՆԹ-ի կրկնակի պարույրի կայունությունը և նվազեցնելով ԴՆԹ-ի հալման ջերմաստիճանը:PCR փորձերում օգտագործվող ֆորմամիդի կոնցենտրացիան սովորաբար կազմում է 1%-5%:
Տետրամեթիլամոնիումի քլորիդ( TMAC)
Տետրամեթիլամոնիումի քլորիդը կարող է մեծացնել հիբրիդացման առանձնահատկությունը (հիբրիդացման առանձնահատկությունը) և բարձրացնել ԴՆԹ-ի հալման ջերմաստիճանը։Այսպիսով, TMAC-ը կարող է հեռացնել ոչ հատուկ պրիմինգը և նվազեցնել ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի սխալ կապը:Եթե ​​դուք օգտագործում եքայլասերված այբբենարաններPCR ռեակցիայի ժամանակ հիշեք ավելացնել TMAC, որը սովորաբար օգտագործվում է 15-100 մՄ կոնցենտրացիայի դեպքում:
Այլ ընդհանուր հավելումներ
Բացի վերը նշված հավելումների երկու կատեգորիաներից, ՊՇՌ ռեակցիաներում շատ տարածված հավելումներ կան, թեև դրանք տարբեր գործառույթներ ունեն, բայց նաև շատ կարևոր են:
Մագնեզիումի իոն
Մագնեզիումի իոնը պոլիմերազի անփոխարինելի կոֆակտոր է (կոֆակտոր), այսինքն՝ առանց մագնեզիումի իոնի պոլիմերազը անգործուն է։Այնուամենայնիվ, շատ մագնեզիումի իոնները կարող են ազդել նաև պոլիմերազի արդյունավետության վրա:Մագնեզիումի իոնների կոնցենտրացիան յուրաքանչյուր PCR ռեակցիայում տարբեր կլինի:Չելացնող նյութերը (օրինակ՝ EDTA կամ ցիտրատ), dNTP-ների և սպիտակուցների կոնցենտրացիան բոլորն ազդում են մագնեզիումի իոնների կոնցենտրացիայի վրա:Այսպիսով, եթե ձեր PCR փորձի հետ կապված խնդիրներ ունեք, կարող եք փորձել փոխել մագնեզիումի իոնների տարբեր կոնցենտրացիաներ, օրինակ՝ 1,0-ից մինչև 4,0 մՄ՝ 0,5–1 մՄ միջակայքով:
Հարկ է նշել, որ սառեցման-հալման բազմակի ցիկլերը կարող են հանգեցնել մագնեզիումի քլորիդի լուծույթի կոնցենտրացիայի շերտավորմանը:Ուստի յուրաքանչյուր օգտագործումից առաջ այն պետք է ամբողջությամբ լուծեք, իսկ օգտագործելուց առաջ լավ խառնեք։
Տավարի շիճուկի ալբումին(Խոզի ալբումին, BSA)
Մոլեկուլային քիմիայի փորձերում տավարի շիճուկի ալբումինը շատ տարածված հավելում է, հատկապես սահմանափակող ֆերմենտների մարսողության և ՊՇՌ փորձերում:PCR ռեակցիաներում BSA-ն օգնում է նվազեցնել աղտոտիչները, ինչպիսիք են ֆենոլային միացությունները:Եվ նաև ասվում է, որ այն կարող է նվազեցնել ռեակտիվների կպչունությունը փորձանոթի պատին:PCR ռեակցիայի ժամանակ սովորաբար ավելացված BSA-ի կոնցենտրացիան կարող է հասնել 0.8 մգ/մլ-ի:
 
Առնչվող ապրանքներ.
PCR հերոս(ներկանյութով)
PCR հերոս