Direct PCR-ը ռեակցիա է, որն ուղղակիորեն օգտագործում է կենդանական կամ բուսական հյուսվածքները ուժեղացման համար՝ առանց նուկլեինաթթվի արդյունահանման:Շատ առումներով ուղղակի PCR-ն աշխատում է սովորական PCR-ի նման

Հիմնական տարբերությունը ուղղակի ՊՇՌ-ում օգտագործվող սովորական բուֆերն է, նմուշը կարող է ուղղակիորեն ենթարկվել PCR ռեակցիայի՝ առանց նուկլեինաթթվի արդյունահանման, սակայն կան համապատասխան պահանջներ ֆերմենտների հանդուրժողականության և ուղղակի PCR ռեակցիայի մեջ ներգրավված բուֆերի համատեղելիության համար:

Թեև սովորական նմուշներում կան քիչ թե շատ PCR ինհիբիտորներ, ուղղակի PCR-ը դեռևս կարող է հասնել հուսալի ուժեղացման ֆերմենտների և բուֆերների ազդեցության տակ:Ավանդական PCR ռեակցիան պահանջում է բարձրորակ նուկլեինաթթու որպես ձևանմուշ, որը կարող է արգելակել PCR ռեակցիայի սահուն ընթացքը, եթե ձևանմուշը պարունակում է սպիտակուցներ և այլ կեղտեր:Direct PCR-ը ներկայումս մոլեկուլային ախտորոշման ոլորտում առավել հայտնի տեխնոլոգիաներից մեկն է:

01 Direct PCR-ն ի սկզբանե օգտագործվել է կենդանիների և բույսերի համար

Ուղղակի PCR-ի ամենավաղ կիրառումը կենդանիների և բույսերի ոլորտում է, ինչպիսիք են առնետի, կատվի, հավի, նապաստակի, ոչխարի, խոշոր եղջերավոր անասունների արյունը, հյուսվածքը և մազը, բույսերի տերևներն ու սերմերը և այլն, որոնք օգտագործվում են գենոտիպավորումը ուսումնասիրելու համար, տրանսգենիկ, պլազմիդի հայտնաբերում, գենի նոկաուտ վերլուծություն, ԴՆԹ-ի աղբյուրի նույնականացում և այլ տեսակների նույնականացում:

Այս դաշտերն ունեն որոշ ընդհանուր առանձնահատկություններ, այսինքն՝ թիրախ գենի պարունակությունը համեմատաբար բարձր է, իսկ նուկլեինաթթվի արդյունահանումը անհանգստացնող է, ուստի ուղղակի PCR-ը կարող է ոչ միայն խնայել ժամանակը և փոքր ազդեցություն ունենալ արդյունքների վրա, այլև խնայել ծախսերը:

Ուղղակի ՊՇՌ-ն, որն օգտագործվում է պաթոգենների հայտնաբերման համար, վերջին տարիների խնդիր է, PCR ռեակտիվների որոշ արտադրողներ նորարարություններ կատարելիս մեծ ջանքեր են գործադրել այս ուղղությամբ:Հատկապես այս COVID-19 համաճարակի ժամանակ շուկայում հայտնվել են հայտնաբերման բազմաթիվ ապրանքներ, ինչպիսիք են SARS-CoV-2 նուկլեինաթթվի հայտնաբերման հավաքածուն (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method), որը հետազոտվել և մշակվել է Foregene-ի կողմից, որն օգտագործում է իրական ժամանակի RT PCR տեխնոլոգիան (rRT-PCR) մարդկային նուկլեինաթթուների որակական հայտնաբերման կամ SARS-CoV-2-ի որակական հայտնաբերման համար: ալ շվաբրի նմուշներ:

Foregene-ն այն ընկերություններից է, որն օգտագործում է Direct PCR տեխնոլոգիան՝ նորմալ ORF1ab, N, E և հայտնաբերման համար:տարբերակ նուկլեինաթթուների տոհմերը մարդկային քիթ-կոկորդային կամ բերանային շվաբրի նմուշներում, ինչպիսիք են SARS-CoV-2 B.1.1.7 տոհմը (Մեծ Բրիտանիա), B.1.351 տոհմը (ZA), B.1.617 տոհմը (IND) և P.1 տոհմը (BR):

02  Ուղղակի ՊՇՌ-ի համար անհրաժեշտ ռեակտիվներ

Լիզատի նմուշ

Նմուշի լիզատը կարող է կազմաձևվել ինքներդ կամ գնել:Տարբեր ապրանքանիշերի լիզատի բաղադրության տարբերությունը կտարբերի լիզինգի ունակությունը, և այնուհետև լիզինգի ժամանակը մի փոքր այլ կլինի:Օրինակ, կենդանիների հյուսվածքների նմուշների պատրաստման համար սովորաբար խորհուրդ է տրվում 30 րոպե կամ գիշերվա լիզում, իսկ վիրուսների լիզի լուծույթը տատանվում է 3-10 րոպեի սահմաններում:

PCR վարպետ խառնուրդ

Խորհուրդ է տրվում օգտագործել տաք մեկնարկային ԴՆԹ պոլիմերազ՝ հատուկ ուժեղացման և ուժեղացման կարողությունը բարձրացնելու համար:Ուղղակի ՊՇՌ-ի հիմքը բարձր հանդուրժողականություն ունեցող պոլիմերազ է:

Վերացնել կամ արգելակել նմուշի բաղադրիչները, որոնք ազդում են ԴՆԹ-ի ուժեղացման վրա

Նմուշը լիզատով մշակելուց հետո սպիտակուցներ, լիպիդներ և այլ բջջային մնացորդներ կազատվեն, այդ նյութերը կխանգարեն PCR ռեակցիան:Հետևաբար, ուղղակի ՊՇՌ-ն պահանջում է համապատասխան հեռացման կամ ինհիբիտորների ավելացում՝ այդ գործոնների ազդեցությունը նվազեցնելու համար:

03  Ուղղակի ՊՇՌ-ի հինգ գիտելիքների հավաքածու

Նախ, Direct PCR տեխնոլոգիան ուղղակի PCR տեխնոլոգիա է տարբեր կենսաբանական նմուշների համար:Այս տեխնիկական պայմաններում կարիք չկա առանձնացնել և արդյունահանել նուկլեինաթթուն, ուղղակիորեն օգտագործել հյուսվածքի նմուշը որպես առարկա և ավելացնել թիրախային գենի պրայմերները, որոնք պետք է կատարեն PCR ռեակցիան:

Երկրորդ, Direct PCR տեխնոլոգիան ոչ միայն ավանդական ԴՆԹ կաղապարի ուժեղացման տեխնոլոգիա է, այլ նաև ներառում է ՌՆԹ կաղապարի հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR:

Երրորդ, Direct PCR տեխնոլոգիան ոչ միայն ուղղակիորեն իրականացնում է սովորական որակական PCR ռեակցիաներ հյուսվածքների նմուշների վրա, այլև ներառում է իրական ժամանակի qPCR ռեակցիաներ, ինչը պահանջում է, որ ռեակցիայի համակարգը ունենա հակաֆոնային ֆլյուորեսցենտային միջամտության հզոր հնարավորություն, իսկ էնդոգեն ֆլյուորեսցենտը նվազեցնում է անտագոնիստական ​​կարողությունը:

Չորրորդ՝ Direct PCR տեխնոլոգիայի թիրախավորված նմուշներին անհրաժեշտ է միայն նուկլեինաթթվի ձևանմուշներ, և չեն հեռացնում սպիտակուցները, պոլիսախարիդները, աղի իոնները և այլն, որոնք խանգարում են PCR ռեակցիային:Այն պահանջում է, որ ռեակցիայի համակարգում նուկլեինաթթվի պոլիմերազը և PCR Mix-ը ունենան գերազանց դիմադրություն և հարմարվողականություն՝ բարդ պայմաններում ֆերմենտի ակտիվությունն ու վերարտադրման ճշգրտությունը ապահովելու համար:

Հինգերորդ, ուղղակի PCR տեխնոլոգիայով թիրախավորված հյուսվածքի նմուշը, առանց որևէ նուկլեինաթթվի հարստացման բուժման, և կաղապարի քանակը շատ փոքր է, ինչը պահանջում է, որ ռեակցիայի համակարգը չափազանց բարձր զգայունություն և ուժեղացման արդյունավետություն ունենա: