Մոլեկուլային ախտորոշման տեխնոլոգիան օգտագործում է մոլեկուլային կենսաբանության մեթոդներ՝ հայտնաբերելու մարդու մարմնի գենետիկական նյութի և տարբեր պաթոգենների արտահայտվածությունն ու կառուցվածքը՝ հիվանդությունների կանխատեսման և ախտորոշման նպատակին հասնելու համար:

Վերջին տարիներին, մոլեկուլային ախտորոշման տեխնոլոգիայի արդիականացման և կրկնության հետ մեկտեղ, մոլեկուլային ախտորոշման կլինիկական կիրառումը դարձել է ավելի ու ավելի լայնածավալ և խորը, և մոլեկուլային ախտորոշման շուկան թեւակոխել է արագ զարգացման շրջան:

Հեղինակն ամփոփում է շուկայում առկա տարածված մոլեկուլային ախտորոշման տեխնոլոգիաները և բաժանված է երեք մասի. առաջին մասը ներկայացնում է PCR տեխնոլոգիան, երկրորդ մասը ներկայացնում է նուկլեինաթթվի իզոթերմային ուժեղացման տեխնոլոգիան, իսկ երկրորդ մասը ներկայացնում է հաջորդականության տեխնոլոգիան:

01

Մաս I. PCR տեխնոլոգիա

PCR տեխնոլոգիա

PCR (պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա) ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի in vitro տեխնոլոգիաներից է, որն ունի ավելի քան 30 տարվա պատմություն:

PCR տեխնոլոգիան ստեղծվել է 1983 թվականին ԱՄՆ-ի Սետուս քաղաքից Կարի Մալիսի կողմից:Մալիսը PCR արտոնագրի համար դիմեց 1985 թվականին և նույն տարում հրատարակեց գիտության վերաբերյալ առաջին PCR ակադեմիական աշխատանքը:Մալիսը քիմիայի ոլորտում Նոբելյան մրցանակի է արժանացել 1993 թվականին։

PCR-ի հիմնական սկզբունքները

PCR-ն կարող է ուժեղացնել թիրախային ԴՆԹ-ի բեկորները ավելի քան մեկ միլիոն անգամ:Սկզբունքը կայանում է նրանում, որ ԴՆԹ պոլիմերազի կատալիզացման ժամանակ հիմնական շղթայի ԴՆԹ-ն օգտագործվում է որպես ձևանմուշ, իսկ հատուկ այբբենարան՝ որպես ընդլայնման մեկնարկային կետ:Այն կրկնօրինակվում է in vitro քայլերի միջոցով, ինչպիսիք են դենատուրացիան, կռումը և երկարացումը:Դստեր շղթայի ԴՆԹ-ի գործընթացը, որը լրացնում է մայր շղթայի ԴՆԹ-ի ձևանմուշը:

Ստանդարտ PCR գործընթացը բաժանված է երեք փուլի.

1. Դենատուրացիա. ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթաները առանձնացնելու համար օգտագործեք բարձր ջերմաստիճան:ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթաների միջև ջրածնային կապերը կոտրվում են բարձր ջերմաստիճանում (93-98°C):

2. Եռացում. երկշղթա ԴՆԹ-ն առանձնացնելուց հետո ջերմաստիճանն իջեցվում է այնպես, որ այբբենարանը կարող է միանալ միաշղթա ԴՆԹ-ին:

3. Ընդլայնում. ԴՆԹ պոլիմերազը սկսում է սինթեզել լրացուցիչ շղթաներ ԴՆԹ-ի շղթաների երկայնքով կապված այբբենարաններից, երբ ջերմաստիճանը իջնում ​​է:Երբ ընդլայնումն ավարտվում է, ավարտվում է ցիկլը, և ԴՆԹ-ի բեկորների թիվը կրկնապատկվում է:

Այս երեք քայլերը 25-35 անգամ փոխադարձ կատարելով՝ ԴՆԹ-ի բեկորների թիվը երկրաչափորեն կաճի:

PCR-ի հնարամտությունը կայանում է նրանում, որ տարբեր պրայմերներ կարող են նախագծվել տարբեր թիրախային գեների համար, որպեսզի թիրախ գենի բեկորները կարող են ուժեղացվել կարճ ժամանակահատվածում:

Առայժմ ՊՇՌ-ն կարելի է բաժանել երեք կատեգորիայի՝ սովորական ՊՇՌ, լյումինեսցենտ քանակական ՊՇՌ և թվային ՊՇՌ:

Սովորական PCR-ի առաջին սերունդը

Թիրախային գենը ուժեղացնելու համար օգտագործեք սովորական PCR ուժեղացման գործիք, այնուհետև օգտագործեք ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզ՝ արտադրանքը հայտնաբերելու համար, միայն որակական վերլուծություն կարելի է անել:

Առաջին սերնդի PCR-ի հիմնական թերությունները.

-Հակված է ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման և կեղծ դրական արդյունքների:

-Հայտնաբերումը երկար է տևում, իսկ վիրահատությունը՝ ծանր:

-Միայն որակական թեստավորում կարելի է անել։

Երկրորդ սերնդի ֆլուորեսցենտային քանակական PCR

Ֆլուորեսցենտային քանակական PCR (Real-Time PCR), որը նաև հայտնի է որպես qPCR, օգտագործվում է ուժեղացված արտադրանքների կուտակումը վերահսկելու համար լյումինեսցենտային ազդանշանների կուտակման միջոցով՝ ավելացնելով լյումինեսցենտային զոնդեր, որոնք կարող են ցույց տալ ռեակցիայի համակարգի առաջընթացը և դատել արդյունքները ֆլյուորեսցենտային կորի միջոցով, և այն կարելի է չափել C-ի կորի արժեքի օգնությամբ:

Քանի որ qPCR տեխնոլոգիան իրականացվում է փակ համակարգում, աղտոտման հավանականությունը նվազում է, և ֆլյուորեսցենտային ազդանշանը կարող է վերահսկվել քանակական հայտնաբերման համար, ուստի այն կլինիկական պրակտիկայում առավել լայնորեն կիրառվում է և դարձել է գերիշխող տեխնոլոգիա PCR-ում:

Իրական ժամանակի լյումինեսցենտային քանակական PCR-ում օգտագործվող լյումինեսցենտային նյութերը կարելի է բաժանել TaqMan լյումինեսցենտային զոնդերի, մոլեկուլային փարոսների և լյումինեսցենտային ներկերի:

1) TaqMan լյումինեսցենտային զոնդ.

PCR ամպլիֆիկացիայի ժամանակ ավելացվում է հատուկ լյումինեսցենտային զոնդ՝ միաժամանակ ավելացնելով զույգ պրայմերներ:Զոնդը օլիգոնուկլեոտիդ է, և երկու ծայրերը համապատասխանաբար պիտակավորված են ռեպորտաժային լյումինեսցենտային և մարող ֆլուորեսցենտային խմբերով:

Երբ զոնդն անձեռնմխելի է, լյումինեսցենտային ազդանշանը, որը թողարկվում է թղթակից խմբի կողմից, կլանվում է մարման խմբի կողմից;PCR ամպլիֆիկացիայի ժամանակ Taq ֆերմենտի 5'-3' էկզոնուկլեազային ակտիվությունը ճեղքում և քայքայում է զոնդը՝ դարձնելով ռեպորտաժի ֆլուորեսցենտային խումբ և մարող։ լյումինեսցենտային ազդանշանը լիովին համաժամանակացված է PCR արտադրանքի ձևավորման հետ:

2) SYBR լյումինեսցենտային ներկանյութեր.

PCR ռեակցիայի համակարգում ավելացվում է SYBR լյումինեսցենտային ներկի ավելցուկ:Այն բանից հետո, երբ SYBR լյումինեսցենտային ներկը ոչ հատուկ կերպով ընդգրկվում է ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթայի մեջ, այն արձակում է լյումինեսցենտ ազդանշան:SYBR ներկի մոլեկուլը, որը ներառված չէ շղթայի մեջ, չի արձակի որևէ լյումինեսցենտ ազդանշան՝ դրանով իսկ ապահովելով լյումինեսցենտային ազդանշանը:SYBR-ը կապվում է միայն երկշղթա ԴՆԹ-ի հետ, ուստի հալման կորը կարող է օգտագործվել որոշելու համար, թե արդյոք PCR ռեակցիան սպեցիֆիկ է:

3) Մոլեկուլային փարոսներ

Այն ցողունային օղակով կրկնակի պիտակավորված օլիգոնուկլեոտիդային զոնդ է, որը 5 և 3 ծայրերում կազմում է մոտ 8 հիմքից կազմված մազակալի կառուցվածք:Երկու ծայրերում գտնվող նուկլեինաթթուների հաջորդականությունները փոխլրացուցիչ կերպով զուգակցված են, ինչը հանգեցնում է լյումինեսցենտային խմբի և մարման խմբի խիտ լինելուն:Փակեք, այն ֆլյուորեսցենտ չի արտադրի:

PCR արտադրանքի գեներացումից հետո, եռացման գործընթացում, մոլեկուլային փարոսի միջին մասը զուգակցվում է հատուկ ԴՆԹ-ի հաջորդականության հետ, և լյումինեսցենտ գենը առանձնացվում է մարող գենից՝ ֆլյուորեսցենտ արտադրելու համար:

Երկրորդ սերնդի PCR-ի հիմնական թերությունները.

Զգայունությունը դեռևս բացակայում է, և ցածր պատճենված նմուշների հայտնաբերումը ճշգրիտ չէ:

Կա ֆոնային արժեքի ազդեցություն, և արդյունքը ենթակա է միջամտության:

Երրորդ սերնդի թվային PCR

Թվային PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) հաշվարկում է թիրախային հաջորդականության պատճենների թիվը վերջնական կետի հայտնաբերման միջոցով և կարող է կատարել ճշգրիտ բացարձակ քանակական հայտնաբերում առանց ներքին հսկողության և ստանդարտ կորերի օգտագործման:

Թվային PCR-ն օգտագործում է վերջնական կետի հայտնաբերում և կախված չէ Ct արժեքից (ցիկլի շեմից), ուստի թվային PCR ռեակցիան ավելի քիչ է ազդում ուժեղացման արդյունավետությունից, և PCR ռեակցիայի արգելակիչների նկատմամբ հանդուրժողականությունը բարելավվում է՝ բարձր ճշգրտությամբ և վերարտադրելիությամբ:

Բարձր զգայունության և բարձր ճշգրտության բնութագրերի շնորհիվ այն հեշտությամբ չի խանգարվում PCR ռեակցիայի ինհիբիտորներով, և այն կարող է հասնել իրական բացարձակ քանակականացման առանց ստանդարտ արտադրանքների, որոնք դարձել են հետազոտության և կիրառման թեժ կետ:

Ըստ ռեակցիայի միավորի տարբեր ձևերի՝ այն կարելի է բաժանել երեք տեսակի՝ միկրոհեղուկ, չիպային և կաթիլային համակարգեր։