Ct արժեքը լյումինեսցենտ քանակական PCR-ի արդյունքների ներկայացման ամենակարևոր ձևն է:Այն օգտագործվում է գեների արտահայտման տարբերությունները կամ գեների պատճենների թիվը հաշվարկելու համար:Այսպիսով, ո՞րն է լյումինեսցենցիայի քանակական արժեքի Ct-ի արժեքը, որը համարվում է ողջամիտ:Ինչպե՞ս ապահովել Ct արժեքի արդյունավետ միջակայքը:

Ի՞նչ է Ct արժեքը:
qPCR ուժեղացման գործընթացում համապատասխան թվով ուժեղացման ցիկլեր (ցիկլի շեմ), երբ ուժեղացված արտադրանքի ֆլյուորեսցենտային ազդանշանը հասնում է սահմանված ֆլուորեսցենտային շեմին:C-ն նշանակում է ցիկլ, իսկ T-ն նշանակում է շեմ:Պարզ ասած, Ct արժեքը ցիկլերի քանակն է, որը համապատասխանում է, երբ նախնական կաղապարի ուժեղացումը հասնում է արտադրանքի որոշակի քանակի qPCR-ում:Այսպես կոչված «որոշակի քանակի արտադրանքը» ավելի ուշ կբացատրվի:

Ի՞նչ է անում Ct արժեքը:

1. Էքսպոնենցիալ ուժեղացման, կաղապարի քանակի և Ct արժեքի միջև կապը
Իդեալում, qPCR-ում գեները կուտակվում են էքսպոնենցիալ ուժեղացման միջոցով որոշակի թվով ցիկլերից հետո:Ուժեղացման ցիկլերի քանակի և արտադրանքի քանակի միջև կապը հետևյալն է․Այնուամենայնիվ, qPCR ռեակցիան միշտ չէ, որ իդեալական իրավիճակում է:Երբ ուժեղացված արտադրանքի քանակը հասնում է «որոշակի արտադրանքի քանակի», ցիկլերի քանակը այս պահին Ct արժեքն է, և այն գտնվում է էքսպոնենցիալ ուժեղացման շրջանում:Ct արժեքի և սկզբնական ձևանմուշի քանակի միջև կապը. Կաղապարի Ct արժեքի և կաղապարի սկզբնական պատճենի համարի լոգարիթմի միջև կա գծային հարաբերություն:Որքան բարձր է կաղապարի սկզբնական կոնցենտրացիան, այնքան փոքր է Ct արժեքը;որքան ցածր է կաղապարի սկզբնական կոնցենտրացիան, այնքան մեծ է Ct արժեքը:

2. Ուժեղացման կորը, ֆլուորեսցենտային շեմը և որոշակի PCR արտադրանքի քանակությունը
qPCR ուժեղացման արտադրանքի քանակն ուղղակիորեն ներկայացված է լյումինեսցենտային ազդանշանի, այսինքն՝ ուժեղացման կորի տեսքով։PCR-ի վաղ փուլում ուժեղացումը կատարվում է իդեալական պայմաններում, ցիկլերի քանակը փոքր է, արտադրանքի կուտակումը փոքր է, և ֆլյուորեսցենցիայի մակարդակը չի կարող հստակորեն տարբերվել ֆլյուորեսցենտային ֆոնից:Դրանից հետո ֆլյուորեսցենտը մեծանում է և անցնում էքսպոնենցիալ փուլ։PCR արտադրանքի քանակը կարող է հայտնաբերվել որոշակի կետում, երբ PCR ռեակցիան գտնվում է հենց էքսպոնենցիալ փուլում, որը կարող է օգտագործվել որպես «որոշ քանակությամբ արտադրանք», և դրանից կարելի է եզրակացնել կաղապարի սկզբնական պարունակությունը:Հետևաբար, ֆլուորեսցենտային ազդանշանի ինտենսիվությունը, որը համապատասխանում է արտադրանքի որոշակի քանակին, լյումինեսցենտային շեմն է:

ՊՇՌ-ի ուշ փուլում ուժեղացման կորը այլևս չի ցուցադրում էքսպոնենցիալ ուժեղացում և մտնում է գծային և բարձրավանդակի փուլ:

3. Ct արժեքների վերարտադրելիություն
Երբ PCR ցիկլը հասնում է Ct արժեքի ցիկլի համարին, այն նոր է մտել իրական էքսպոնենցիալ ուժեղացման շրջանը:Այս պահին փոքր սխալը չի ​​ուժեղացվել, ուստի Ct արժեքի վերարտադրելիությունը գերազանց է, այսինքն՝ նույն ձևանմուշը ուժեղացվում է տարբեր ժամանակներում կամ միաժամանակ տարբեր խողովակներում։Ուժեղացում, ստացված Ct արժեքը հաստատուն է։

1. Ուժեղացման արդյունավետություն En
PCR-ի ուժեղացման արդյունավետությունը վերաբերում է այն արդյունավետությանը, որով պոլիմերազը փոխակերպում է ուժեղացման ենթակա գենը ամպլիկոնի:Ամրապնդման արդյունավետությունը, երբ ԴՆԹ-ի մեկ մոլեկուլը փոխակերպվում է երկու ԴՆԹ մոլեկուլների, կազմում է 100%:Ուժեղացման արդյունավետությունը սովորաբար արտահայտվում է որպես En.Հետագա հոդվածների վերլուծությունը հեշտացնելու համար համառոտ ներկայացվում են այն գործոնները, որոնք ազդում են ուժեղացման արդյունավետության վրա:

2. Ct արժեքների միջակայք
Ct արժեքները տատանվում են 15-35-ի սահմաններում:Եթե ​​Ct-ի արժեքը 15-ից փոքր է, ապա համարվում է, որ ուժեղացումը գտնվում է բազային ժամանակաշրջանի միջակայքում, և ֆլյուորեսցենցիայի շեմը չի հասել:Իդեալում, Ct արժեքի և կաղապարի սկզբնական պատճենի համարի լոգարիթմի, այսինքն՝ ստանդարտ կորի միջև կա գծային հարաբերություն։Ստանդարտ կորի միջոցով, երբ ուժեղացման արդյունավետությունը 100% է, Ct-ի հաշվարկված արժեքը գենի մեկ օրինակի թիվը քանակականացնելու համար կազմում է մոտ 35: Եթե այն 35-ից մեծ է, ապա կաղապարի սկզբնական պատճենի թիվը տեսականորեն 1-ից փոքր է, ինչը կարելի է համարել անիմաստ:

Գենի տարբեր Ct միջակայքերի համար, գենի պատճենների թվի տարբերության և սկզբնական ձևանմուշի ուժեղացման արդյունավետության պատճառով, անհրաժեշտ է կազմել գենի համար ստանդարտ կոր և հաշվարկել գենի գծային հայտնաբերման միջակայքը:

3. Ct արժեքի ազդող գործոններ
Ուժեղացման ցիկլերի քանակի և արտադրանքի քանակի փոխհարաբերությունից. ուժեղացված արտադրանքի քանակը = սկզբնական ձևանմուշի քանակությունը × (1+En) ցիկլի համարը, կարելի է տեսնել, որ իդեալական պայմաններում սկզբնական ձևանմուշի և En-ի քանակը բացասական ազդեցություն կունենա Ct արժեքի վրա:Կաղապարի որակի կամ ուժեղացման արդյունավետության տարբերությունը կհանգեցնի նրան, որ Ct արժեքը չափազանց մեծ կամ շատ փոքր կլինի:

4.Ct արժեքը չափազանց մեծ է կամ չափազանց փոքր