Իրական ժամանակում PCR, որը նաև հայտնի է որպես քանակական PCR կամ qPCR, PCR ուժեղացման արտադրանքի իրական ժամանակի մոնիտորինգի և վերլուծության մեթոդ է:
Քանի որ քանակական PCR-ն ունի պարզ գործողության, արագ և հարմար, բարձր զգայունության, լավ կրկնելիության և աղտոտման ցածր արագության առավելությունները, այն լայնորեն օգտագործվում է բժշկական փորձարկումների, դեղերի արդյունավետության գնահատման, գեների արտահայտման հետազոտության, տրանսգենային հետազոտությունների, գեների հայտնաբերման, պաթոգենների հայտնաբերման, կենդանիների և բույսերի հայտնաբերման մեջ:, սննդի փորձարկում և այլ ոլորտներ։
Հետևաբար, անկախ նրանից՝ դուք զբաղվում եք կենսաբանական գիտությունների հիմնարար հետազոտություններով, կամ դեղագործական ընկերությունների, անասնաբուծական ընկերությունների, սննդի ընկերությունների, կամ նույնիսկ մուտքի-ելքի տեսչական և կարանտինային բյուրոների, շրջակա միջավայրի մոնիտորինգի բաժանմունքների, հիվանդանոցների և այլ ստորաբաժանումների աշխատակիցներ, դուք քիչ թե շատ կենթարկվեք կամ պետք է իմանաք քանակական PCR-ի յուրացման գիտելիքները:

Իրական ժամանակում PCR-ի սկզբունքը

Իրական ժամանակում PCR-ը մեթոդ է, որում լյումինեսցենտային նյութեր ավելացվում են PCR ռեակցիայի համակարգին, և PCR ռեակցիայի գործընթացում ֆլուորեսցենտային ազդանշանի ինտենսիվությունը իրական ժամանակում վերահսկվում է քանակական PCR գործիքի միջոցով, և վերջապես փորձարարական տվյալները վերլուծվում և մշակվում են:

【Ուժեղացման կոր】ՊՇՌ-ի դինամիկ ընթացքը նկարագրող կորն է:PCR-ի ուժեղացման կորը իրականում ոչ թե ստանդարտ էքսպոնենցիալ կոր է, այլ սիգմոիդ կոր:

[Ուժեղացման կորի հարթակի փուլ]ՊՇՌ ցիկլերի քանակի ավելացման, ԴՆԹ պոլիմերազի անակտիվացման, dNTP-ների և պրայմերների սպառման և ռեակցիայի կողմնակի արտադրանքի պիրոֆոսֆատի կողմից սինթեզի ռեակցիայի արգելակման և այլնի հետ, ՊՇՌ-ն միշտ չէ, որ ընդլայնվում է էքսպոնենցիալ:, և ի վերջո կմտնի սարահարթ:

[Ուժեղացման կորի էքսպոնենցիալ աճի շրջան]Չնայած սարահարթի փուլը մեծապես տարբերվում է, ուժեղացման կորի էքսպոնենցիալ աճի շրջանի որոշակի շրջանում կրկնելիությունը շատ լավ է, ինչը շատ կարևոր է ՊՇՌ-ի քանակական վերլուծության համար:

[Շեմային արժեքը և Ct արժեքը]Մենք սահմանում ենք ֆլյուորեսցենցիայի հայտնաբերման սահմանային արժեքը ուժեղացման կորի էքսպոնենցիալ աճի տարածքում համապատասխան դիրքում, այն է՝ շեմային արժեքը (Շեմ):Շեմային արժեքի և ուժեղացման կորի հատումը Ct արժեքն է, այսինքն, Ct արժեքը վերաբերում է ցիկլերի քանակին (շեմային ցիկլ), երբ հասնում է շեմային արժեքը:

Ստորև բերված գրաֆիկը հստակ ցույց է տալիս շեմային գծի և ուժեղացման կորի, շեմի և Ct արժեքի միջև կապը:

【Ինչպե՞ս քանակականացնել:】

Մաթեմատիկական տեսությամբ ապացուցվել է, որ Ct արժեքը հակադարձ գծային կապ ունի սկզբնական կաղապարների քանակի լոգարիթմի հետ։Իրական ժամանակում PCR-ն իրական ժամանակում վերահսկում է PCR ուժեղացման արտադրանքները և քանակականացնում դրանք էքսպոնենցիալ ուժեղացման փուլում:

ՊՇՌ-ի յուրաքանչյուր ցիկլի համար ԴՆԹ-ն երկրաչափականորեն ավելացել է 2 անգամ և շուտով հասել է բարձրության:

Ենթադրելով, որ մեկնարկային ԴՆԹ-ի քանակը Ա₀ n ցիկլից հետո ԴՆԹ-ի արտադրանքի տեսական քանակը կարող է արտահայտվել հետևյալ կերպ.

A _n =A ₀ × 2ⁿ

Այնուհետև, որքան շատ է նախնական ԴՆԹ քանակությունը A 0, այնքան ավելի շուտ ուժեղացված արտադրանքի քանակը հասնում է հայտնաբերման An արժեքին, իսկ An-ին հասնելու ժամանակ ցիկլերի քանակը Ct արժեքն է:Այսինքն, որքան շատ է սկզբնական ԴՆԹ քանակությունը A 0, այնքան ավելի վաղ է ուժեղացման կորը հասնում գագաթնակետին, և համապատասխանաբար n ցիկլերի պահանջվող թիվը փոքր է:

Մենք իրականացնում ենք հայտնի կոնցենտրացիայի ստանդարտի գրադիենտ նոսրացում և այն օգտագործում ենք որպես իրական ժամանակի ՊՇՌ-ի ձևանմուշ, և հավասար ընդմիջումներով ձեռք կբերվեն մի շարք ուժեղացման կորեր՝ ԴՆԹ-ի սկզբնական քանակի ավելի շատից պակաս կարգով:Ըստ Ct արժեքի և մեկնարկային ձևանմուշների քանակի լոգարիթմի գծային հարաբերությունների՝ ա.[ստանդարտ կորը] կարող է ստեղծվել:

Անհայտ կոնցենտրացիայով նմուշի Ct արժեքը ստանդարտ կորի մեջ փոխարինելով՝ կարելի է ստանալ անհայտ կոնցենտրացիայով նմուշի սկզբնական չափը, որը իրական ժամանակում PCR-ի քանակական սկզբունքն է:

Իրական ժամանակում PCR-ի հայտնաբերման մեթոդ

Իրական ժամանակում PCR-ն հայտնաբերում է PCR ուժեղացման արտադրանքները՝ հայտնաբերելով ռեակցիայի համակարգում ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը:

Լյումինեսցենտային ներկերի ներդրման մեթոդի սկզբունքը】

Լյումինեսցենտային ներկեր, ինչպիսին է TB Green ®-ը, կարող է ոչ սպեցիֆիկ կերպով կապվել ՊՇՌ համակարգերում կրկնակի շղթաներով ԴՆԹ-ին և կապվելուց հետո ֆլյուորեսցեն:

Ֆլյուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը ռեակցիայի համակարգում էքսպոնենցիալ աճում է ՊՇՌ ցիկլերի ավելացման հետ:Ֆլուորեսցենցիայի ինտենսիվությունը հայտնաբերելով, ռեակցիայի համակարգում ԴՆԹ-ի ուժեղացման քանակը կարող է վերահսկվել իրական ժամանակում, այնուհետև նմուշի սկզբնական ձևանմուշի քանակը կարող է հակառակ գնահատվել:

【Լյումինեսցենտային զոնդի մեթոդի սկզբունքը】

լյումինեսցենտային զոնդնուկլեինաթթուների հաջորդականություն է՝ 5′ ծայրում լյումինեսցենտային խումբով և 3′ ծայրում` մարող խումբով, որը կարող է հատուկ կապվել կաղապարի հետ:Երբ զոնդն անձեռնմխելի է, ֆտորոֆորի արտանետվող ֆլուորեսցենտը մարվում է մարման խմբի կողմից և չի կարող լյումինեսթանալ:Երբ զոնդը քայքայվում է, լյումինեսցենտային նյութը կտարանջատվի և արձակում է ֆլյուորեսցենտ:

PCR ռեակցիայի լուծույթին ավելացվում է լյումինեսցենտային զոնդ:Կառուցման գործընթացի ընթացքում լյումինեսցենտային զոնդը կկապվի կաղապարի հատուկ դիրքի հետ:Ընդլայնման գործընթացում PCR ֆերմենտի 5'→3' էկզոնուկլեազային ակտիվությունը կարող է քայքայել կաղապարի հետ հիբրիդացված լյումինեսցենտային զոնդը, և լյումինեսցենտային նյութը տարանջատվել՝ արտանետելու ֆլյուորեսցենտ:Արձագանքման համակարգում զոնդի ֆլյուորեսցենտային ինտենսիվությունը հայտնաբերելու միջոցով կարելի է հասնել PCR արտադրանքի ուժեղացման քանակի մոնիտորինգի նպատակին:

【Լյումինեսցենտային հայտնաբերման մեթոդի ընտրություն】

Եթե ​​այն օգտագործվում է բարձր հոմոլոգիայով հաջորդականությունները տարբերելու և մուլտիպլեքսային PCR հայտնաբերման համար, ինչպես օրինակ՝ SNP-ի տիպային վերլուծությունը, ապա լյումինեսցենտային զոնդի մեթոդն անփոխարինելի է:
Իրական ժամանակում PCR-ի այլ փորձերի համար կարող է օգտագործվել պարզ, հեշտ և էժան ֆլուորեսցենտային քիմերային մեթոդ:

զոնդներ Ուժեղ յուրահատկություն, ունակ է մուլտիպլեքսային PCR

Թերություն

Ուժեղացման բարձր կոնկրետության պահանջներ;

մուլտիպլեքսային PCR չի կարող իրականացվել: Պետք է նախագծել հատուկ զոնդեր, բարձր արժեք;

երբեմն զոնդի նախագծումը դժվար է

Առնչվող ապրանքներ.