PCR-ը նուկլեինաթթվի ուժեղացման տեխնոլոգիան է և լայնորեն կիրառվում է իր զգայունության և յուրահատկության շնորհիվ:Այնուամենայնիվ, PCR-ը պահանջում է կրկնակի ջերմային դենատուրացիա և չի կարող ազատվել գործիքների և սարքավորումների վրա հիմնվելու սահմանափակումներից, ինչը սահմանափակում է դրա կիրառումը կլինիկական դաշտային փորձարկումներում:

1990-ականների սկզբից շատ լաբորատորիաներ սկսել են մշակել մշտական ​​ջերմաստիճանի ուժեղացման տեխնոլոգիա, որը չի պահանջում ջերմային դենատուրացիա:Այժմ նրանք մշակել են օղակով միջնորդավորված իզոթերմային ուժեղացման տեխնոլոգիա, շղթայի փոխարինման իզոթերմային ուժեղացման տեխնոլոգիա, գլորվող շրջանի իզոթերմային ուժեղացման տեխնոլոգիա և նուկլեինաթթուների հաջորդականության կախվածություն:Իզոթերմային ուժեղացման տեխնոլոգիա և այլ տեխնոլոգիաներ: 

Loop միջնորդավորված իզոթերմային ուժեղացում

Ուժեղացման սկզբունքը հիմնված է այն փաստի վրա, որ ԴՆԹ-ն գտնվում է դինամիկ հավասարակշռության վիճակում մոտ 65°C ջերմաստիճանում։Երբ որևէ այբբենարան բազային զույգ է և տարածվում է երկշղթա ԴՆԹ-ի լրացուցիչ մասի վրա, մյուս շարանը կտարանջատվի և կդառնա միաշղթա:

Այս ջերմաստիճանում ԴՆԹ-ն օգտագործում է 4 հատուկ այբբենարան՝ շղթայի տեղաշարժով ԴՆԹ-ի պոլիմերազին ապավինելու համար, որպեսզի շղթայի տեղաշարժով ԴՆԹ-ի սինթեզը շարունակաբար շրջանառվի:

Նախ որոշեք F3, F2, F1, B1, B2, B3 6 հատուկ շրջանները թիրախ գենի վրա, այնուհետև նախագծեք 4 այբբենարան՝ հիմնվելով այս 6 հատուկ շրջանների վրա (ինչպես ցույց է տրված ստորև նկարում).

Առջևի ներքին այբբենարանը (FIP) կազմված է F1c և F2-ից:

Հետամնաց ներքին այբբենարանը (BIP) կազմված է B1c և B2-ից, իսկ TTTT-ն օգտագործվում է որպես միջնամասում:

Արտաքին պրայմերները F3 և B3 համապատասխանաբար կազմված են թիրախ գենի F3 և B3 շրջաններից:

LAMP ռեակցիայի համակարգում ներքին այբբենարանի կոնցենտրացիան մի քանի անգամ գերազանցում է արտաքին այբբենարանի կոնցենտրացիան:Ներքին այբբենարանը սկզբում զուգակցվում է կաղապարի շղթայի հետ, որպեսզի սինթեզվի լրացուցիչ շղթա՝ ձևավորելով ԴՆԹ կրկնակի շղթա:Այնուհետև արտաքին այբբենարանը միացվում է կաղապարի շղթայի հետ՝ ձևավորելով ԴՆԹ կրկնակի շղթա:BstDNA պոլիմերազի ազդեցության ներքո ներքին այբբենարանի կողմից սինթեզված կոմպլեմենտար շարանը ազատվում է:Մի շարք ռեակցիաներից հետո լրացնող շարանը վերջապես ձևավորում է ԴՆԹ-ի մեկ շղթա՝ համրային կառուցվածքով:

Համրային կառուցվածքի ԴՆԹ-ի մեկ շղթան ինքնին օգտագործվում է որպես ձևանմուշ՝ շարունակաբար ձևավորելու բաց ծայրով անցումային ցողունային հանգույց ԴՆԹ:Ներքին և արտաքին այբբենարանները ուղղորդում են անցումային ցողունային հանգույցի կառուցվածքի ԴՆԹ-ն, որպեսզի շարունակաբար ենթարկվի շղթայի տեղաշարժման և ընդլայնման ռեակցիաներին, և վերջապես ձևավորեն ցողունային հանգույցների մի քանի կառուցվածքներ տարբեր երկարություններով:ԴՆԹ խառնուրդ.

Օղակով միջնորդավորված իզոթերմային ուժեղացման առավելություններն ու թերությունները

LAMP-ի առավելությունները.

(1) Բարձր ուժեղացման արդյունավետություն, որը կարող է արդյունավետորեն ուժեղացնել թիրախային գենի 1-10 օրինակը 1 ժամվա ընթացքում, և ուժեղացման արդյունավետությունը 10-100 անգամ գերազանցում է սովորական PCR-ին:

(2) Ռեակցիայի ժամանակը կարճ է, առանձնահատկությունը ուժեղ է, և հատուկ սարքավորում չի պահանջվում:

LAMP-ի թերությունները.

(1) Հատկապես բարձր են այբբենարանների պահանջները:

(2) Ընդլայնված արտադրանքը չի կարող օգտագործվել կլոնավորման և հաջորդականության համար, այլ կարող է օգտագործվել միայն դատողությունների համար:

(3) Իր ուժեղ զգայունության շնորհիվ հեշտ է ձևավորել աերոզոլներ՝ առաջացնելով կեղծ դրական արդյունքներ և ազդելով թեստի արդյունքների վրա:

Sտրենդի տեղաշարժի ուժեղացում

Շղթայի տեղաշարժի ուժեղացումը (SDA) in vitro իզոթերմային ԴՆԹ-ի ուժեղացման մեթոդ է, որը հիմնված է ֆերմենտային ռեակցիայի վրա, որն առաջին անգամ առաջարկվել է ամերիկացի գիտնական Ուոքերի կողմից 1992 թվականին:

SDA-ի հիմնական համակարգը ներառում է սահմանափակող էնդոնուկլեազա, շղթայի տեղաշարժման ակտիվությամբ ԴՆԹ պոլիմերազ, երկու զույգ պրայմերներ, dNTPs և կալցիումի և մագնեզիումի իոններ և բուֆերային համակարգեր:

Շղթայի տեղաշարժի ուժեղացման սկզբունքը հիմնված է թիրախ ԴՆԹ-ի երկու ծայրերում քիմիապես փոփոխված սահմանափակող էնդոնուկլեազի ճանաչման հաջորդականության վրա:Էնդոնուկլեազը բացում է շղթայի ԴՆԹ-ի բացը իր ճանաչման վայրում, իսկ ԴՆԹ պոլիմերազը երկարացնում է բացը 3' վերջ և փոխարինում հաջորդ ԴՆԹ շղթան:

ԴՆԹ-ի փոխարինված միայնակ շղթաները կարող են զուգակցվել այբբենարանների հետ և ԴՆԹ պոլիմերազի միջոցով երկարացնել կրկնակի շղթաների:Այս գործընթացը շարունակաբար կրկնվում է, որպեսզի թիրախային հաջորդականությունը արդյունավետորեն ուժեղացվի:

Շղթայի տեղաշարժի ուժեղացման տեխնոլոգիայի առավելություններն ու թերությունները

SDA-ի առավելությունները.

Ուժեղացման արդյունավետությունը բարձր է, արձագանքման ժամանակը կարճ է, սպեցիֆիկությունը ուժեղ է, և հատուկ սարքավորում չի պահանջվում:

SDA-ի թերությունները.

Արտադրանքները միատեսակ չեն, և որոշ միաշղթա և երկշղթա արտադրանք միշտ արտադրվում են SDA ցիկլում, և պոչամբարը անխուսափելիորեն տեղի կունենա, երբ հայտնաբերվի էլեկտրոֆորեզով:

Rolling շրջանակի ուժեղացում

Գլորվող շրջանի ուժեղացումը (RCA) առաջարկվում է ախտածին օրգանիզմներից ԴՆԹ-ի պտտվող շրջանի միջոցով պատճենելու մեթոդի հիման վրա:Այն վերաբերում է միաշղթա շրջանաձև ԴՆԹ-ի օգտագործմանը որպես կաղապար՝ հաստատուն ջերմաստիճանում, և հատուկ ԴՆԹ պոլիմերազի (օրինակ՝ Phi29) ) ԴՆԹ-ի պտտվող շրջանի սինթեզի գործողության ներքո՝ նպատակային գենի ուժեղացմանը հասնելու համար:

RCA-ն կարելի է բաժանել գծային ուժեղացման և էքսպոնենցիալ ուժեղացման:Գծային RCA-ի արդյունավետությունը կարող է հասնել 10-ի⁵անգամ, իսկ էքսպոնենցիալ RCA-ի արդյունավետությունը կարող է հասնել 10-ի⁹անգամ։

Պարզ տարբերակում, ինչպես ցույց է տրված ստորև նկարում, գծային ուժեղացումը a օգտագործում է միայն 1 այբբենարան, էքսպոնենցիալ ուժեղացումը b ունի 2 այբբենարան:

Գծային RCA-ն կոչվում է նաև մեկ այբբենարան RCA:Պրայմերը կապվում է շրջանաձև ԴՆԹ-ի հետ և տարածվում ԴՆԹ պոլիմերազի ազդեցությամբ:Արտադրանքը գծային միայնակ շղթա է, որն ունի մեծ թվով կրկնվող հաջորդականություն, որը հազարապատիկ մեծ է մեկ օղակի երկարությունից:

Քանի որ գծային RCA-ի արտադրանքը միշտ միացված է մեկնարկային այբբենարանին, ազդանշանի հեշտ ամրագրումը մեծ առավելություն է:

Էքսպոնենցիալ RCA, որը նաև հայտնի է որպես Hyper ճյուղավորված ուժեղացում HRCA (Hyper ճյուղավորված RCA), էքսպոնենցիալ RCA-ում, մեկ այբբենարան ուժեղացնում է RCA արտադրանքը, երկրորդ այբբենարանը հիբրիդացվում է RCA արտադրանքի հետ և տարածվում, և փոխարինումն արդեն կապված է RCA արտադրանքի հետ: Ներքևի պրայմերները երկարացնում են շարանը, և կրկնում են ընդլայնման և փոխարինման RCA արտադրանքը:

Շրջանակի նուկլեինաթթվի ուժեղացման առավելություններն ու թերությունները

RCA-ի առավելությունները.

Բարձր զգայունություն, լավ առանձնահատկություն և հեշտ գործարկում:

RCA-ի թերությունները.

Ֆոնային խնդիրներ ազդանշանի հայտնաբերման ժամանակ:RCA ռեակցիայի ընթացքում չշրջանառվող կողպեքի զոնդը և չկապված զոնդի ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի ձևանմուշը կարող են առաջացնել որոշ ֆոնային ազդանշաններ: 

Nucleicacid-ի հաջորդականության վրա հիմնված ուժեղացում

Նուկլեինաթթուների հաջորդականության վրա հիմնված ուժեղացումը (NASBA) նոր տեխնոլոգիա է, որը մշակվել է PCR-ի հիման վրա:Այն իրենից ներկայացնում է շարունակական և իզոթերմային նուկլեինաթթվի ուժեղացում, որն առաջնորդվում է T7 պրոմոտորային հաջորդականությամբ զույգ պրայմերներով:Տեխնոլոգիան կարող է մոտ 2 ժամում մոտ 109 անգամ ուժեղացնել ՌՆԹ-ի կաղապարը, ինչը 1000 անգամ գերազանցում է սովորական PCR մեթոդը և հատուկ սարքավորում չի պահանջում։

Այս տեխնոլոգիան օգտագործվել է հիվանդությունների ի հայտ գալուն պես արագ ախտորոշման համար, և շատ ընկերություններ ներկայումս օգտագործում են այս մեթոդը ՌՆԹ հայտնաբերման փաթեթներում:

Թեև ՌՆԹ-ի ուժեղացումը կարող է նաև օգտագործել հակադարձ արտագրման PCR տեխնոլոգիա, NASBA-ն ունի իր առավելությունները. այն կարող է իրականացվել համեմատաբար կայուն ջերմաստիճանի պայմաններում և ավելի կայուն և ճշգրիտ է, քան ավանդական PCR տեխնոլոգիան:

Ռեակցիան 41 աստիճան Ցելսիուսում է և ավարտելու համար պահանջվում է AMV (թռչնի միելոբլաստոզ վիրուս) հակադարձ տրանսկրիպտազ, RNase H, T7 ՌՆԹ պոլիմերազ և մի զույգ պրայմերներ:

Գործընթացը հիմնականում ներառում է.

Առաջատար այբբենարանը պարունակում է T7 պրոմոտորի լրացուցիչ հաջորդականությունը:Ռեակցիայի ընթացքում առաջնային այբբենարանը կապվում է ՌՆԹ շղթային և կատալիզացվում է AMV ֆերմենտի կողմից՝ ձևավորելով ԴՆԹ-ՌՆԹ կրկնակի շղթա։

RNase H-ը մարսում է ՌՆԹ-ն հիբրիդային երկշղթայի մեջ և պահպանում միաշղթա ԴՆԹ-ն:

Հակադարձ այբբենարանի և AMV ֆերմենտի գործողության ներքո ձևավորվում է ԴՆԹ կրկնակի շղթա, որը պարունակում է T7 պրոմոտորի հաջորդականությունը:

T7 ՌՆԹ պոլիմերազի ազդեցությամբ տրանսկրիպցիոն գործընթացն ավարտվում է և մեծ քանակությամբ թիրախային ՌՆԹ է արտադրվում։

NASBA-ի առավելությունները.

(1) Դրա այբբենարանն ունի T7 խթանող հաջորդականություն, սակայն օտարերկրյա երկշղթա ԴՆԹ-ն չունի T7 պրոմոտորի հաջորդականություն և չի կարող ուժեղացվել, ուստի այս տեխնոլոգիան ունի բարձր առանձնահատկություն և զգայունություն:

(2) NASBA-ն ուղղակիորեն ներառում է հակադարձ տառադարձման գործընթացը ուժեղացման ռեակցիայի մեջ՝ կրճատելով ռեակցիայի ժամանակը:

NASBA-ի թերությունները.

(1) Ռեակցիայի բաղադրիչները ավելի բարդ են:

(2) Երեք տեսակի ֆերմենտներ են պահանջվում ռեակցիայի արժեքն ավելի բարձր դարձնելու համար: