PCR (պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա) ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի in vitro տեխնոլոգիաներից մեկն է, որն ունի ավելի քան 30 տարվա պատմություն:

PCR տեխնոլոգիան ստեղծվել է ԱՄՆ-ի Կետուս քաղաքից Կարի Մալիսի կողմից 1983 թվականին: Մալիսը դիմել է PCR արտոնագրի համար 1985 թվականին և նույն թվականին հրատարակել գիտության վերաբերյալ առաջին PCR ակադեմիական աշխատանքը:Մալիսն իր աշխատանքի համար 1993 թվականին արժանացել է քիմիայի Նոբելյան մրցանակի։

PCR-ի հիմնական սկզբունքները

PCR-ն կարող է ուժեղացնել թիրախային ԴՆԹ-ի բեկորները ավելի քան մեկ միլիոն անգամ:Սկզբունքը գտնվում է ԴՆԹ պոլիմերազի կատալիզացման ներքո՝ օգտագործելով մայր շղթայի ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ և հատուկ այբբենարան՝ որպես ընդլայնման մեկնարկային կետ:Այն կրկնօրինակվում է in vitro քայլերի միջոցով, ինչպիսիք են դենատուրացիան, կռումը և երկարացումը:Դստեր շղթայի ԴՆԹ-ի գործընթացը, որը լրացնում է մայր շղթայի ԴՆԹ-ի ձևանմուշը:

Ստանդարտ PCR գործընթացը բաժանված է երեք փուլի.

ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթաները բաժանելու համար օգտագործեք բարձր ջերմաստիճան:ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթաների միջև ջրածնային կապը կոտրվում է բարձր ջերմաստիճանում (93-98℃):

2. Կռում. Կրկնաշղթա ԴՆԹ-ն առանձնացնելուց հետո իջեցրեք ջերմաստիճանը, որպեսզի այբբենարանը կարողանա միանալ միաշղթա ԴՆԹ-ին:

3. Ընդարձակում. ԴՆԹ պոլիմերազը սկսում է սինթեզել լրացուցիչ շղթաներ ԴՆԹ-ի շղթաների երկայնքով պրայմերներից, որոնք կապված են ջերմաստիճանի իջեցման ժամանակ:Երբ ընդլայնումն ավարտվում է, ավարտվում է ցիկլը, և ԴՆԹ-ի բեկորների թիվը կրկնապատկվում է

Այս երեք քայլերը 25-35 անգամ փոխադարձ կատարելով՝ ԴՆԹ-ի բեկորների թիվը երկրաչափորեն կաճի:

PCR-ի հնարամտությունն այն է, որ տարբեր պրայմերներ կարող են նախագծվել տարբեր թիրախային գեների համար, այնպես որ թիրախ գենի բեկորները կարճ ժամանակահատվածում կարող են ուժեղացվել:

Առայժմ ՊՇՌ-ն կարելի է բաժանել երեք կատեգորիայի՝ սովորական ՊՇՌ, լյումինեսցենտ քանակական ՊՇՌ և թվային ՊՇՌ:

Սովորական PCR-ի առաջին սերունդը

Թիրախային գենը ուժեղացնելու համար օգտագործեք սովորական PCR ուժեղացման գործիք, այնուհետև օգտագործեք ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզ՝ արտադրանքը հայտնաբերելու համար, միայն որակական վերլուծություն կարելի է անել:

Առաջին սերնդի PCR-ի հիմնական թերությունները.

1.Հակված է ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման և կեղծ դրական արդյունքների:

2. Հայտնաբերումը երկար ժամանակ է պահանջում, և վիրահատությունը ծանր է:

3. Միայն որակական թեստ կարելի է անել

Երկրորդ սերնդի իրական ժամանակի PCR

Իրական ժամանակի PCR-ը, որը նաև հայտնի է որպես qPCR, օգտագործում է լյումինեսցենտային զոնդեր, որոնք կարող են ցույց տալ ռեակցիայի համակարգի առաջընթացը և վերահսկում է ուժեղացված արտադրանքի կուտակումը լյումինեսցենտային ազդանշանների կուտակման միջոցով և դատում արդյունքները լյումինեսցենտային կորի միջոցով:Այն կարելի է քանակականացնել Cq արժեքի և ստանդարտ կորի օգնությամբ:

Քանի որ qPCR տեխնոլոգիան իրականացվում է փակ համակարգում, աղտոտման հավանականությունը նվազում է, և ֆլյուորեսցենտային ազդանշանը կարող է վերահսկվել քանակական հայտնաբերման համար, ուստի այն կլինիկական պրակտիկայում առավել լայնորեն կիրառվում է և դարձել է գերիշխող տեխնոլոգիա PCR-ում:

Իրական ժամանակի լյումինեսցենտային քանակական PCR-ում օգտագործվող լյումինեսցենտային նյութերը կարելի է բաժանել TaqMan լյումինեսցենտային զոնդի, մոլեկուլային փարոսների և լյումինեսցենտային ներկերի:

1) TaqMan լյումինեսցենտային զոնդ.

PCR ամպլիֆիկացիայի ժամանակ ավելացվում է հատուկ լյումինեսցենտային զոնդ՝ միաժամանակ ավելացնելով զույգ այբբենարան:Զոնդը օլիգոնուկլեոտիդ է, և երկու ծայրերը պիտակավորված են ռեպորտաժային լյումինեսցենտային և մարող ֆլուորեսցենտային խմբով:

Երբ զոնդն անձեռնմխելի է, լյումինեսցենտային ազդանշանը, որը թողարկվում է թղթակից խմբի կողմից, կլանվում է մարման խմբի կողմից;PCR ամպլիֆիկացիայի ժամանակ Taq ֆերմենտի 5'-3' էկզոնուկլեազային ակտիվությունը ճեղքում և քայքայում է զոնդը՝ դարձնելով ռեպորտաժի ֆլուորեսցենտային խումբ և մարող։ լյումինեսցենտային ազդանշանը լիովին համաժամանակացված է PCR արտադրանքի ձևավորման հետ:

2) SYBR լյումինեսցենտային ներկ.

PCR ռեակցիայի համակարգում ավելացվում է SYBR լյումինեսցենտային ներկի ավելցուկ:Այն բանից հետո, երբ SYBR լյումինեսցենտային ներկը ոչ հատուկ կերպով ընդգրկվում է ԴՆԹ-ի կրկնակի շղթայի մեջ, այն արձակում է լյումինեսցենտ ազդանշան:SYBR ներկի մոլեկուլը, որը ներառված չէ շղթայի մեջ, չի արձակի որևէ լյումինեսցենտ ազդանշան՝ դրանով իսկ ապահովելով լյումինեսցենտային ազդանշանը:SYBR-ը կապվում է միայն երկշղթա ԴՆԹ-ի հետ, ուստի հալման կորը կարող է օգտագործվել որոշելու համար, թե արդյոք PCR ռեակցիան սպեցիֆիկ է:

3) Մոլեկուլային փարոս.

Այն ցողունային օղակով կրկնակի պիտակավորված օլիգոնուկլեոտիդային զոնդ է, որը 5 և 3 ծայրերում կազմում է մոտ 8 հիմքից կազմված մազակալի կառուցվածք:Երկու ծայրերում գտնվող նուկլեինաթթուների հաջորդականությունները փոխլրացուցիչ կերպով զուգակցված են, ինչը հանգեցնում է լյումինեսցենտային խմբի և մարման խմբի խիտ լինելուն:Փակեք, ֆլուորեսցենտ չի արտադրվի:

PCR արտադրանքի գեներացումից հետո, եռացման գործընթացում, մոլեկուլային փարոսի միջին մասը զուգակցվում է հատուկ ԴՆԹ-ի հաջորդականության հետ, և լյումինեսցենտ գենը առանձնացվում է մարող գենից՝ ֆլյուորեսցենտ արտադրելու համար:

Երկրորդ սերնդի PCR-ի հիմնական թերությունները.

Զգայունությունը դեռևս բացակայում է, իսկ ցածր պատճենված նմուշների հայտնաբերումը ճշգրիտ չէ:

Կա ֆոնային արժեքի ազդեցությունը, և արդյունքը ենթակա է միջամտության:

Երբ ռեակցիայի համակարգում կան PCR ինհիբիտորներ, հայտնաբերման արդյունքները ենթակա են միջամտության:

Երրորդ սերնդի թվային PCR

Թվային PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) հաշվարկում է թիրախային հաջորդականության պատճենների թիվը վերջնական կետի հայտնաբերման միջոցով և կարող է կատարել ճշգրիտ բացարձակ քանակական հայտնաբերում առանց ներքին հսկողության և ստանդարտ կորերի օգտագործման:

Թվային PCR-ն օգտագործում է վերջնական կետի հայտնաբերում և կախված չէ Ct արժեքից (ցիկլի շեմից), ուստի թվային PCR ռեակցիան ավելի քիչ է ազդում ուժեղացման արդյունավետությունից, և PCR ռեակցիայի արգելակիչների նկատմամբ հանդուրժողականությունը բարելավվում է՝ բարձր ճշգրտությամբ և վերարտադրելիությամբ:

Բարձր զգայունության և բարձր ճշգրտության բնութագրերի շնորհիվ այն հեշտությամբ չի խանգարվում PCR ռեակցիայի ինհիբիտորներով, և այն կարող է հասնել իրական բացարձակ քանակականացման առանց ստանդարտ արտադրանքների, որոնք դարձել են հետազոտության և կիրառման թեժ կետ:

Ըստ ռեակցիայի միավորի տարբեր ձևերի՝ այն կարելի է բաժանել երեք հիմնական տեսակի՝ միկրոհեղուկ, չիպային և կաթիլային համակարգեր։

1) Microfluidic թվային PCR, mdPCR:

Միկրոհեղուկ տեխնոլոգիայի հիման վրա ԴՆԹ-ի կաղապարն առանձնացվում է։Միկրոհեղուկ տեխնոլոգիան կարող է իրականացնել նմուշի նանո-արդիականացում կամ ավելի փոքր կաթիլների առաջացում, սակայն կաթիլներին անհրաժեշտ է հատուկ կլանման մեթոդ, այնուհետև համատեղել PCR ռեակցիայի համակարգի հետ:mdPCR-ն աստիճանաբար ընդունվել է փոխարինելու այլ մեթոդներով:

2) Կաթիլների վրա հիմնված թվային PCR, ddPCR.

Օգտագործեք ջուրը նավթի կաթիլների ստեղծման տեխնոլոգիան նմուշը կաթիլների վերածելու համար և նուկլեինաթթվի մոլեկուլներ պարունակող ռեակցիայի համակարգը բաժանեք հազարավոր նանոմաշտաբի կաթիլների, որոնցից յուրաքանչյուրը չի պարունակում նուկլեինաթթվի թիրախային մոլեկուլը, որը պետք է հայտնաբերվի, կամ պարունակում է մեկից մի քանի նուկլեինաթթվի թիրախային մոլեկուլներ, որոնք պետք է փորձարկվեն:

3) Chip-ի վրա հիմնված թվային PCR, cdPCR.

Օգտագործեք հեղուկի ինտեգրված ուղիների տեխնոլոգիան՝ բազմաթիվ միկրոխողովակներ և միկրոխոռոչներ փորագրելու համար սիլիկոնային վաֆլիների կամ քվարցային ապակու վրա և վերահսկելու լուծույթի հոսքը տարբեր հսկիչ փականների միջոցով, և նմուշի հեղուկը նույն չափի նանոմետրերի բաժանեք ռեակցիայի հորերի մեջ թվային PCR Reaction-ի համար՝ հասնելու բացարձակ քանակականացման:

Երրորդ սերնդի PCR-ի հիմնական թերությունները.

Սարքավորումներն ու ռեակտիվները թանկ են։

Կաղապարի որակի պահանջները բարձր են:Եթե ​​ձևանմուշի քանակը գերազանցում է միկրոհամակարգի քանակությունը, ապա այն անհնար կլինի քանակականացնել, իսկ եթե այն շատ փոքր է, քանակական ճշգրտությունը կնվազի:

Կեղծ պոզիտիվներ կարող են առաջանալ նաև, երբ կա ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում: