COVID-19-ը վարակիչ հիվանդություն է, որն առաջանում է 2-րդ տիպի կորոնավիրուսային ծանր սուր շնչառական համախտանիշով: Երբ մարդը վարակվում է, ամենատարածված ախտանիշները ներառում են ջերմություն, հազ և շնչահեղձություն:

Փորձարկման համար օգտագործվող նմուշները կարող են հավաքվել քիթ-կոկորդային շվաբրերի կամ օրոֆարինգալային շվաբրերի միջոցով:

Ի՞նչ է PCR-ը:

Կորոնավիրուսի հայտնաբերման ստանդարտ մեթոդը պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան է՝ PCR։Սա մոլեկուլային կենսաբանության մեջ լայնորեն կիրառվող մեթոդ է։Այն կարող է արագ պատճենել միլիոնավոր ԴՆԹ-ի միլիարդավոր կոնկրետ բեկորներ:

Նոր կորոնավիրուսը պարունակում է շատ երկար միաշղթա ՌՆԹ գենոմ:Այս վիրուսները PCR-ով հայտնաբերելու համար ՌՆԹ-ի մոլեկուլները պետք է փոխարկվեն իրենց լրացուցիչ ԴՆԹ-ի հաջորդականությունների՝ հակադարձ տրանսկրիպտազի միջոցով, այնուհետև նոր սինթեզված ԴՆԹ-ն կարող է ուժեղացվել ստանդարտ PCR պրոցեդուրաներով, որը սովորաբար հայտնի է որպես RT-PCR:

RT-PCR գործընթաց

ՌՆԹ արդյունահանում

Այս մեթոդն իրականացնելու համար վիրուսային ՌՆԹ-ն հիմնականում պետք է արդյունահանվի:ՌՆԹ-ի մաքրման մի շարք փաթեթներ կարող են օգտագործվել հարմար, արագ և արդյունավետ տարանջատման համար:

Առևտրային հավաքածուի միջոցով վիրուսային ՌՆԹ արդյունահանելու համար նախ նմուշը ավելացրեք միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ և այնուհետև խառնեք այն լիզի բուֆերի հետ:Այս բուֆերը շատ դենատուրացված է և սովորաբար բաղկացած է ֆենոլից և գուանիդինի իզոթիոցիանատից:Բացի այդ, RNase-ի ինհիբիտորները սովորաբար առկա են լիզի բուֆերում՝ ապահովելու անձեռնմխելի վիրուսային ՌՆԹ-ի մեկուսացումը:

Լիզիսի բուֆերը ավելացնելուց հետո խառնիչ խողովակը իմպուլսով պտտեցնել և ինկուբացնել սենյակային ջերմաստիճանում:Այնուհետև վիրուսը լուծվում է լիզի բուֆերի կողմից տրամադրված խիստ դենատուրացնող պայմաններում:

Նմուշը լուծվելուց հետո մաքրման ընթացակարգի համար օգտագործվում է ցենտրիֆուգային խողովակ:Նմուշը բեռնվում է ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ և այնուհետև ցենտրիֆուգվում:

Այս պրոցեդուրան պինդ փուլային արդյունահանման մեթոդ է, որտեղ ստացիոնար փուլը բաղկացած է սիլիկա գելի մատրիցից:

Աղի և pH-ի օպտիմալ պայմաններում ՌՆԹ-ի մոլեկուլները կապվում են սիլիցիումի թաղանթին:

Միեւնույն ժամանակ, սպիտակուցը եւ այլ աղտոտիչները հեռացվում են:

Ցենտրիֆուգումից հետո ցենտրիֆուգային խողովակը դրեք մաքուր հավաքման խողովակի մեջ, դեն նետեք ֆիլտրատը և ավելացրեք լվացքի բուֆեր:

Խողովակը նորից դրեք ցենտրիֆուգի մեջ, որպեսզի լվացքի բուֆերը մեմբրանի միջով անցնի:Սա կհեռացնի մնացած բոլոր կեղտերը թաղանթից՝ թողնելով միայն ՌՆԹ-ն կապված սիլիկա գելի հետ:

Նմուշը լվանալուց հետո խողովակը դրեք մաքուր միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ և ավելացրեք էլյուցիոն բուֆեր:

Այնուհետև այն ցենտրիֆուգվում է, որպեսզի լուծարման բուֆերը մեմբրանի միջով անցնի:Էլուցիոն բուֆերը հեռացնում է վիրուսային ՌՆԹ-ն սպին սյունակից և ստանում մաքրված ՌՆԹ՝ զերծ սպիտակուցներից, ինհիբիտորներից և այլ աղտոտիչներից:

ՔԱՅԼ 2

Խառը խտանյութ

Վիրուսային ՌՆԹ-ի արդյունահանումից հետո հաջորդ քայլը ռեակցիոն խառնուրդի պատրաստումն է ՊՇՌ ուժեղացման համար:Այս քայլում օգտագործվում է խտանյութ:Այս խտացված լուծույթը նախախառնված խտացված լուծույթ է, որը բաղկացած է պրեմիքսից, հակադարձ տրանսկրիպտազից, նուկլեոտիդներից, առաջնային այբբենարանից, հակադարձ այբբենարանից, TaqMan զոնդից և ԴՆԹ պոլիմերազից:

Ի վերջո, այս ռեակցիայի խառնուրդը ավարտելու համար ավելացվում է ՌՆԹ կաղապարը:Խողովակները խառնվում են իմպուլսային պտտման միջոցով, այնուհետև ռեակցիայի խառնուրդը բեռնվում է PCR ափսեի մեջ:PCR ափսեը սովորաբար պարունակում է 96 հորեր և կարող է միաժամանակ վերլուծել բազմաթիվ նմուշներ:

ՔԱՅԼ 3

PCR ուժեղացում

Հաջորդը, ափսեը տեղադրեք PCR մեքենայի մեջ, որն ըստ էության ջերմային ցիկլեր է:

Իրական ժամանակի RT-PCR-ն օգտագործվում է 2019 թվականի նոր կորոնավիրուսը հայտնաբերելու համար՝ ուժեղացնելով թիրախային հաջորդականությունը RdrRP գենում, E գենում և N գենում:Թիրախային գենի ընտրությունը կախված է պրայմերից և զոնդերի հաջորդականությունից:

RT-PCR-ի առաջին քայլը հակադարձ արտագրումն է:Կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ի առաջին շղթան սինթեզվում է, որը սկսվում է PCR հակադարձ այբբենարանով, որը կապվում է վիրուսային ՌՆԹ գենոմի կոմպլեմենտար մասի հետ։Այնուհետև հակադարձ տրանսկրիպտազը ԴՆԹ նուկլեոտիդներ է ավելացնում այբբենարանի 3' ծայրին՝ վիրուսային ՌՆԹ-ին լրացնող ԴՆԹ սինթեզելու համար:Այս քայլի ջերմաստիճանը և տևողությունը կախված են օգտագործվող պրայմերներից, թիրախային ՌՆԹ-ից և հակադարձ տրանսկրիպտազից:

Այնուհետև կիրառվում է դենատուրացիայի սկզբնական քայլ, որի արդյունքում տեղի է ունենում ՌՆԹ-ԴՆԹ հիբրիդի դենատուրացիա:Այս քայլն անհրաժեշտ է ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվացման համար:Միևնույն ժամանակ, հակադարձ տրանսկրիպտազը ապաակտիվացված է:

PCR-ն բաղկացած է մի շարք ջերմային ցիկլերից:Յուրաքանչյուր ցիկլ բաղկացած է դենատուրացիայի, եռացման և երկարացման քայլերից:

Դենատուրացիայի փուլը ներառում է ռեակցիայի խցիկը տաքացնելը մինչև 95 աստիճան Ցելսիուս և այն օգտագործել երկշղթա ԴՆԹ-ի կաղապարի դենատուրացիայի համար:

Հաջորդ քայլում ռեակցիայի ջերմաստիճանը նվազեցվում է մինչև 58 աստիճան Ցելսիուս, ինչը թույլ է տալիս առաջնային այբբենարանին զարկել իր միաշղթա ԴՆԹ-ի կաղապարի լրացուցիչ հատվածը:Հալման ջերմաստիճանը ուղղակիորեն կախված է այբբենարանի երկարությունից և բաղադրությունից:

Ընդլայնման փուլում ԴՆԹ պոլիմերազը սինթեզում է ԴՆԹ-ի նոր շղթա, որը լրացնում է ԴՆԹ-ի կաղապարի շղթան:Կաղապարին լրացնող ազատ միջուկներ ավելացնելով ռեակցիայի խառնուրդից 5'-ից ​​3' ուղղությամբ:Այս քայլի ջերմաստիճանը կախված է օգտագործվող ԴՆԹ պոլիմերազից:

Առաջին ցիկլից հետո ստացվում է ԴՆԹ-ի երկշղթա թիրախ:

Այնուհետև մուտքագրեք երկրորդ ցիկլը:Երկաշղթա ԴՆԹ-ն այլասերվում է՝ առաջացնելով երկու միաշղթա ԴՆԹ մոլեկուլ։

Հաջորդ քայլում ռեակցիայի ջերմաստիճանը իջեցվում է, այբբենարանները զտվում են յուրաքանչյուր միաշղթա ԴՆԹ կաղապարի վրա, իսկ Taq-man զոնդը զտվում է թիրախային ԴՆԹ-ի լրացուցիչ մասի վրա:

TaqMan զոնդը բաղկացած է ֆտորոֆորից, որը կովալենտորեն կապված է օլիգոնուկլեոտիդային զոնդի 5' ծայրին:Երբ ցիկլի լույսի աղբյուրից ոգևորվում է, ֆտորոֆորը լյումինեսցենտ է արձակում:Բացի այդ, զոնդը կազմված է հանգցիչից 3′ վերջում:Ռեպորտաժ գենի մոտիկությունը հանգցնողին խանգարում է ֆլյուորեսցենցիայի հայտնաբերմանը:

Ընդլայնման փուլում ԴՆԹ պոլիմերազը սինթեզում է նոր շղթա:Երբ պոլիմերազը հասնում է TaqMan զոնդին, նրա էնդոգեն 5'նուկլեազային ակտիվությունը կտրում է զոնդը՝ առանձնացնելով ներկը մարող նյութից:

PCR-ի յուրաքանչյուր ցիկլով ներկերի ավելի շատ մոլեկուլներ են արձակվում, ինչը հանգեցնում է ֆլյուորեսցենցիայի ինտենսիվության աճին, որը համաչափ է սինթեզված ամպլիկոնների թվին:

Այս մեթոդը թույլ է տալիս գնահատել նմուշում առկա տվյալ հաջորդականության քանակը:Յուրաքանչյուր ցիկլում կրկնապատկվում է ԴՆԹ-ի երկշղթա բեկորների թիվը:Հետևաբար, PCR-ը կարող է օգտագործվել շատ փոքր նմուշներ վերլուծելու համար:

Լյումինեսցենտային ազդանշանի, վոլֆրամի հալոգեն լամպի, գրգռման ֆիլտրի, ռեֆլեկտորի, ոսպնյակի, արտանետումների ֆիլտրի և լիցքավորման զուգակցված սարքի օգտագործման CCD տեսախցիկի չափման համար:

ՔԱՅԼ 4 Հայտնաբերել

Լյումինեսցենտային ազդանշանի, վոլֆրամի հալոգեն լամպի, գրգռման ֆիլտրի, ռեֆլեկտորի, ոսպնյակի, արտանետումների ֆիլտրի և լիցքավորման զուգակցված սարքի օգտագործման CCD տեսախցիկի չափման համար:

Լամպի զտված լույսը արտացոլվում է ռեֆլեկտորով, անցնում է կոնդենսատորի ոսպնյակի միջով և կենտրոնանում յուրաքանչյուր անցքի կենտրոնում:Այնուհետև անցքից արտանետվող ֆլուորեսցենտը արտացոլվում է հայելից, անցնում արտանետման ֆիլտրով և հայտնաբերվում CCD տեսախցիկով:Յուրաքանչյուր PCR ցիկլում ինքնահուզված ֆտորոֆորի լույսը կարող է հայտնաբերվել CCD-ի կողմից:

Այն գրաված լույսը վերածում է թվային տվյալների:Այս մեթոդը կոչվում է իրական ժամանակի ՊՇՌ, և այն թույլ է տալիս իրական ժամանակում վերահսկել ՊՇՌ ռեակցիայի առաջընթացը: