RT-qPCR մշակվել է սովորական PCR տեխնոլոգիայից:Այն ավելացնում է լյումինեսցենտային քիմիկատներ (լյումինեսցենտային ներկանյութեր կամ լյումինեսցենտային զոնդեր) PCR ռեակցիայի ավանդական համակարգին և իրական ժամանակում հայտնաբերում է PCR-ի եռացման և երկարաձգման գործընթացը՝ ըստ դրանց տարբեր լուսարձակման մեխանիզմների:Լյումինեսցենտային ազդանշանի փոփոխությունները միջավայրում օգտագործվում են PCR-ի յուրաքանչյուր ցիկլում արտադրանքի փոփոխության չափը հաշվարկելու համար:Ներկայումս ամենատարածված մեթոդներն են լյումինեսցենտային ներկերի մեթոդը և զոնդի մեթոդը:

Լյումինեսցենտային ներկման մեթոդ.
Որոշ լյումինեսցենտ ներկանյութեր, ինչպիսիք են SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO և այլն, ինքնուրույն լույս չեն արձակում, բայց dsDNA-ի փոքր ակոսին միանալուց հետո արտանետում են ֆլյուորեսցենտ:Հետևաբար, PCR ռեակցիայի սկզբում մեքենան չի կարող հայտնաբերել լյումինեսցենտային ազդանշանը:Երբ ռեակցիան անցնում է եռացման-ընդլայնման (երկքայլ մեթոդ) կամ երկարացման փուլին (եռաստիճան մեթոդ), կրկնակի շղթաները բացվում են այս պահին, և նոր ԴՆԹ պոլիմերազը Շղթայի սինթեզի ընթացքում լյումինեսցենտային մոլեկուլները միավորվում են dsDNA-ի փոքր ակոսում և արտանետում ֆլյուորեսցենտ:Քանի որ PCR ցիկլերի թիվը մեծանում է, ավելի ու ավելի շատ ներկանյութեր միավորվում են dsDNA-ի հետ, և լյումինեսցենտային ազդանշանը նույնպես անընդհատ ուժեղանում է:Որպես օրինակ վերցրեք SYBR Green Ⅰ:
Զոնդի մեթոդ.
Taqman զոնդը ամենաշատ օգտագործվող հիդրոլիզի զոնդն է:Զոնդի 5′ վերջում կա լյումինեսցենտային խումբ, սովորաբար FAM:Զոնդն ինքնին թիրախ գենին լրացնող հաջորդականություն է:Ֆտորոֆորի 3′ վերջում կա լյումինեսցենտային մարման խումբ:Ֆլյուորեսցենտային ռեզոնանսային էներգիայի փոխանցման սկզբունքի համաձայն (Förster-ի ռեզոնանսային էներգիայի փոխանցում, FRET), երբ հաղորդող լյումինեսցենտային խումբը (դոնոր ֆլուորեսցենտային մոլեկուլ) և մարող լյումինեսցենտ խումբը (ընդունող լյումինեսցենտային մոլեկուլ), երբ գրգռման սպեկտրը համընկնում է, և 7-10-ի մոլեկուլի հեռավորությունը շատ մոտ է. ընդունող մոլեկուլի ֆլուորեսցենցիան, մինչդեռ ավտոֆլյորեսցենտությունը թուլանում է:Հետևաբար, PCR ռեակցիայի սկզբում, երբ զոնդը համակարգում ազատ է և անձեռնմխելի, ռեպորտաժային լյումինեսցենտային խումբը չի արտանետի ֆլյուորեսցենտ:Կառուցելիս այբբենարանը և զոնդը կապվում են կաղապարին:Ընդլայնման փուլում պոլիմերազը շարունակաբար սինթեզում է նոր շղթաներ։ԴՆԹ պոլիմերազը ունի 5'-3' էկզոնուկլեազային ակտիվություն:Զոնդին հասնելիս ԴՆԹ պոլիմերազը կհիդրոլիզացնի զոնդը կաղապարից, կառանձնացնի ռեպորտաժային լյումինեսցենտային խումբը մարող ֆլուորեսցենտային խմբից և կթողարկի լյումինեսցենտային ազդանշանը:Քանի որ կա զոնդի և կաղապարի միջև մեկ առ մեկ հարաբերություն, զոնդի մեթոդը թեստի ճշգրտության և զգայունության առումով գերազանցում է ներկման մեթոդին:

Նկար 1 qRT-PCR-ի սկզբունքը

Այբբենարանի ձևավորում
Սկզբունքները:

Պրայմերները պետք է նախագծված լինեն նուկլեինաթթուների շարքի պահպանված տարածքում և ունենան յուրահատկություն:

Ավելի լավ է օգտագործել cDNA հաջորդականությունը, և mRNA հաջորդականությունը նույնպես ընդունելի է:Եթե ​​ոչ, պարզեք ԴՆԹ-ի հաջորդականության CD-ների շրջանի ձևավորումը:
Լյումինեսցենտային քանակական արտադրանքի երկարությունը 80-150 bp է, ամենաերկարը՝ 300 bp, այբբենարանի երկարությունը հիմնականում 17-25 հիմքերի միջև է, իսկ հոսանքին հակառակ և ներքևի պրայմերների միջև տարբերությունը չպետք է չափազանց մեծ լինի:

G+C-ի պարունակությունը 40%-ից 60% է, իսկ 45-55%-ը լավագույնն է:
TM արժեքը 58-62 աստիճանի սահմաններում է:
Փորձեք խուսափել այբբենարանի դիմերներից և ինքնադիմերներից, (չհայտնվեն ավելի քան 4 զույգ անընդմեջ լրացնող հիմքեր) վարսահարդարման կառուցվածքը, եթե դա անխուսափելի է, դարձրեք ΔG<4,5կՋ/մոլ* Եթե չեք կարող ապահովել, որ gDNA-ն հեռացվել է հակադարձ տրանսկրիպցիայի ժամանակ Մաքուր, ավելի լավ է ձևավորել պրայմերները՝ *3, C ծայրը, որպեսզի խուսափեք GDNA-ից: /C, A/G շարունակական կառուցվածք (2-3) այբբենարաններ և ոչ.
սպեցիֆիկ Տարասեռ ուժեղացված հաջորդականության հոմոլոգիան նախընտրելի է 70%-ից պակաս կամ ունի 8 լրացուցիչ բազային հոմոլոգիա:
Տվյալների բազա:
CottonFGD որոնում հիմնաբառերով
Այբբենարանի ձևավորում.
IDT-qPCR այբբենարանի ձևավորում

Fig2 IDT առցանց այբբենարանի նախագծման գործիքի էջ

Fig3 արդյունքների էջի ցուցադրում
lncRNA այբբենարանների ձևավորում.
lncRNA:նույն քայլերը, ինչ mRNA-ն:
miRNA:Ցողունային հանգույցի մեթոդի սկզբունքը. Քանի որ բոլոր miRNA-ները մոտ 23 նտ-ի կարճ հաջորդականություններ են, ուղղակի PCR-ի հայտնաբերումը չի կարող իրականացվել, ուստի օգտագործվում է ցողունային հանգույցի հաջորդականության գործիքը:Ցողունային հանգույցի հաջորդականությունը մոտ 50 նտ հզորությամբ միաշղթա ԴՆԹ է, որը կարող է ինքնուրույն ձևավորել վարսահարդարիչ կառուցվածք:3 «Վերջը կարող է նախագծվել որպես miRNA մասնակի հատվածին լրացնող հաջորդականություն, այնուհետև թիրախային miRNA-ն կարող է միացվել ցողունային հանգույցի հաջորդականությանը հակադարձ տառադարձման ժամանակ, և ընդհանուր երկարությունը կարող է հասնել 70 bp, ինչը համահունչ է qPCR-ով որոշված ​​ուժեղացված արտադրանքի երկարությանը:Պոչամբարի miRNA այբբենարանի ձևավորում:
Ուժեղացման հատուկ հայտնաբերում.
Առցանց պայթյունի տվյալների բազա. CottonFGD պայթյուն ըստ հաջորդականության նմանության
Local blast. Տեսեք Blast+-ի օգտագործումը լոկալ պայթյուն կատարելու համար, Linux-ը և macos-ը կարող են ուղղակիորեն ստեղծել տեղական տվյալների բազա, win10 համակարգը կարող է իրականացվել նաև ubuntu bash-ը տեղադրելուց հետո:Ստեղծեք տեղական պայթյունի տվյալների բազա և տեղական պայթյուն;բացել ubuntu bash-ը win10-ում:
Ծանուցում. բարձրադիր բամբակը և ծովային կղզու բամբակը տետրապլոիդ մշակաբույսեր են, ուստի պայթյունի արդյունքը հաճախ կլինի երկու կամ ավելի լուցկի:Նախկինում, օգտագործելով NAU cds-ը որպես տվյալների բազա պայթյուն իրականացնելու համար, հավանաբար կգտնվեն երկու հոմոլոգ գեներ՝ ընդամենը մի քանի SNP տարբերություններով:Սովորաբար, երկու հոմոլոգ գեները չեն կարող առանձնացվել այբբենարանի ձևավորման միջոցով, ուստի դրանք վերաբերվում են որպես նույնը:Եթե ​​ակնհայտ ինդել կա, ապա այբբենարանը սովորաբար նախագծվում է ինդելի վրա, բայց դա կարող է հանգեցնել այբբենարանի երկրորդական կառուցվածքի: Ազատ էներգիան դառնում է ավելի բարձր, ինչը հանգեցնում է ուժեղացման արդյունավետության նվազմանը, բայց դա անխուսափելի է:

Այբբենարանի երկրորդական կառուցվածքի հայտնաբերում.
Քայլեր:բաց oligo 7 → մուտքագրման կաղապարի հաջորդականությունը → փակել ենթապատուհանը → պահպանել → տեղադրել այբբենարանը կաղապարի վրա, սեղմել ctrl+D՝ այբբենարանի երկարությունը սահմանելու համար → վերլուծել տարբեր երկրորդական կառուցվածքներ, ինչպիսիք են ինքնադիմերացման մարմինը, հետերոդիմեր, վարսահարդարիչ, անհամապատասխանություն և այլն: Նկար 4-ի վերջին երկու նկարները պրիմերի փորձարկման արդյունքներն են:Առջևի այբբենարանի արդյունքը լավ է, չկա ակնհայտ դիմերի և մազակալի կառուցվածք, չկա շարունակական փոխլրացնող հիմքեր, և ազատ էներգիայի բացարձակ արժեքը 4,5-ից պակաս է, իսկ հետևի այբբենարանը ցույց է տալիս շարունակական 6 հիմքերը փոխլրացնող են, իսկ ազատ էներգիան 8,8 է;Բացի այդ, 3′ վերջում հայտնվում է ավելի լուրջ դիմեր, և 4 հաջորդական հիմքերի դիմեր:Չնայած ազատ էներգիան բարձր չէ, 3' dimer Chl-ը կարող է լրջորեն ազդել ուժեղացման առանձնահատկությունների և ուժեղացման արդյունավետության վրա:Բացի այդ, անհրաժեշտ է ստուգել մազակալների, հետերոդիմերների և անհամապատասխանությունների առկայությունը:

Fig3 oligo7 հայտնաբերման արդյունքներ
Ուժեղացման արդյունավետության հայտնաբերում.
PCR ռեակցիայի ուժեղացման արդյունավետությունը լրջորեն ազդում է PCR արդյունքների վրա:Նաև qRT-PCR-ում ուժեղացման արդյունավետությունը հատկապես կարևոր է քանակական արդյունքների համար:Հեռացրեք այլ նյութեր, մեքենաներ և արձանագրություններ ռեակցիայի բուֆերում:Պրայմերների որակը նույնպես մեծ ազդեցություն ունի qRT-PCR-ի ուժեղացման արդյունավետության վրա:Արդյունքների ճշգրտությունն ապահովելու համար և՛ հարաբերական ֆլուորեսցենտային քանակությունը, և՛ բացարձակ ֆլուորեսցենտային քանակականացումը պետք է հայտնաբերեն պրայմերների ուժեղացման արդյունավետությունը:Հայտնի է, որ արդյունավետ qRT-PCR ուժեղացման արդյունավետությունը 85% -ից 115% է:Երկու եղանակ կա.
1. Ստանդարտ կորի մեթոդ.
ա.Խառնել cDNA
բ.Գրադիենտ նոսրացում
c.qPCR
դ.Գծային ռեգրեսիայի հավասարում ուժեղացման արդյունավետությունը հաշվարկելու համար
2. LinRegPCR
LinRegPCR-ը իրական ժամանակի RT-PCR տվյալների վերլուծության ծրագիր է, որը նաև կոչվում է քանակական PCR (qPCR) տվյալներ՝ հիմնված SYBR Green-ի կամ նմանատիպ քիմիայի վրա:Ծրագիրը օգտագործում է ոչ ելակետային շտկված տվյալներ, կատարում է ելակետային ուղղում յուրաքանչյուր նմուշի վրա առանձին, որոշում է գծայինության պատուհանը և այնուհետև օգտագործում է գծային ռեգրեսիոն վերլուծություն՝ PCR տվյալների հավաքածուի մեջ ուղիղ գիծ տեղավորելու համար:Այս գծի թեքությունից հաշվարկվում է յուրաքանչյուր առանձին նմուշի ՊՇՌ արդյունավետությունը:PCR միջին արդյունավետությունը մեկ ամպլիկոնի համար և Ct արժեքը մեկ նմուշի համար օգտագործվում են մեկ նմուշի մեկնարկային կոնցենտրացիան հաշվարկելու համար՝ արտահայտված կամայական ֆլուորեսցենտային միավորներով:Տվյալների մուտքագրումը և ելքը կատարվում են Excel աղյուսակի միջոցով:Միայն նմուշ
խառնում է պահանջվում, գրադիենտ չկա
քայլեր են պահանջվում.(Վերցրեք Bole CFX96-ը որպես օրինակ, ոչ այնքան մեքենա՝ հստակ ABI-ով)
փորձ:դա ստանդարտ qPCR փորձ է:
qPCR տվյալների ելք.LinRegPCR-ը կարող է ճանաչել ելքային ֆայլերի երկու ձև՝ RDML կամ քանակական ուժեղացման արդյունք:Փաստորեն, դա մեքենայի կողմից ցիկլի թվի և ֆլուորեսցենտային ազդանշանի իրական ժամանակի հայտնաբերման արժեքն է, իսկ ուժեղացումը ստացվում է գծային հատվածի արդյունավետության ֆլյուորեսցենտային փոփոխության արժեքը վերլուծելով:
Տվյալների ընտրությունՏեսականորեն, RDML արժեքը պետք է օգտագործվի:Ենթադրվում է, որ իմ համակարգչի խնդիրն այն է, որ ծրագրաշարը չի կարող ճանաչել RDML-ն, ուստի ես ունեմ excel-ի ելքային արժեքը որպես սկզբնական տվյալ:Առաջարկվում է նախ կատարել տվյալների կոպիտ զննում, օրինակ՝ նմուշների ավելացման ձախողում և այլն: Կետերը կարող են ջնջվել ելքային տվյալների մեջ (իհարկե, դուք չեք կարող ջնջել դրանք, LinRegPCR-ն անտեսելու է այս կետերը հետագա փուլում):

Fig5 qPCR տվյալների արտահանում

Fig6 թեկնածու նմուշների ընտրություն

Տվյալների մուտքագրում.Բացեք որակավորման ուժեղացման results.xls, → բաց LinRegPCR → ֆայլ → կարդալ excel-ից → ընտրել պարամետրերը, ինչպես ցույց է տրված Նկար 7-ում → OK → սեղմեք որոշել բազային գծերը

LinRegPCR տվյալների մուտքագրման Fig7 քայլերը

Արդյունք:Եթե ​​չկա կրկնություն, ապա խմբավորում չի պահանջվում:Եթե ​​կա կրկնություն, ապա խմբավորումը կարող է խմբագրվել նմուշի խմբավորման մեջ, և գենի անունը մուտքագրվում է նույնացուցիչի մեջ, այնուհետև նույն գենը ավտոմատ կերպով կխմբավորվի:Ի վերջո, սեղմեք ֆայլի վրա, արտահանեք Excel և դիտեք արդյունքները:Կցուցադրվեն յուրաքանչյուր հորի ուժեղացման արդյունավետությունը և R2 արդյունքները:Երկրորդ, եթե բաժանեք խմբերի, կցուցադրվի շտկված միջին ուժեղացման արդյունավետությունը:Համոզվեք, որ յուրաքանչյուր այբբենարանի ուժեղացման արդյունավետությունը 85% -ից 115% է:Եթե ​​այն չափազանց մեծ է կամ շատ փոքր, նշանակում է, որ այբբենարանի ուժեղացման արդյունավետությունը վատ է:

Նկար 8 Արդյունք և տվյալների ելք

Փորձարարական գործընթաց.
ՌՆԹ որակի պահանջներ.
Մաքրություն:1.72.0-ը ցույց է տալիս, որ կարող է լինել մնացորդային իզոթիոցիանատ:Մաքուր նուկլեինաթթու A260/A230 պետք է լինի մոտ 2: Եթե կա ուժեղ կլանում 230 նմ, դա ցույց է տալիս, որ կան օրգանական միացություններ, ինչպիսիք են ֆենատ իոնները:Բացի այդ, այն կարող է հայտնաբերվել 1,5% ագարոզայի գել էլեկտրոֆորեզով:Նշեք նշիչը, քանի որ ssRNA-ն չունի դենատուրացիա, իսկ մոլեկուլային քաշի լոգարիթմը գծային կապ չունի, և մոլեկուլային քաշը չի կարող ճիշտ արտահայտվել:Համակենտրոնացում՝ տեսականորենոչ100 նգ/ուլ-ից պակաս, եթե կոնցենտրացիան չափազանց ցածր է, մաքրությունը սովորաբար ցածր է, ոչ բարձր

Fig9 ՌՆԹ գել

Բացի այդ, եթե նմուշը թանկարժեք է, իսկ ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան բարձր է, ապա խորհուրդ է տրվում արդյունահանումից հետո այն լուծարել և նոսրացնել ՌՆԹ-ն մինչև 100-300 նգ/ուլ վերջնական կոնցենտրացիան՝ հակադարձ տառադարձման համար:Մեջհակադարձ արտագրման գործընթացը, երբ mRNA-ն տառադարձվում է, օլիգո (dt) պրայմերները, որոնք կարող են հատուկ կապվել polyA պոչերի հետ, օգտագործվում են հակադարձ տառադարձման համար, մինչդեռ lncRNA-ն և circRNA-ն օգտագործում են պատահական հեքսամեր (Պատահական 6 mer) պրայմերներ ընդհանուր ՌՆԹ-ի հակադարձ տրանսկրիպցիայի համար miRNA-ի համար, miRNA-ին հատուկ պարանոցի rescript-loopverse-ի համար օգտագործվում են պրիմերներ:Շատ ընկերություններ այժմ գործարկել են հատուկ պոչամբարների հավաքածուներ:Ցողունային հանգույցի մեթոդի համար պոչամբարի մեթոդն ավելի հարմար է, բարձր թողունակություն և ռեագենտ խնայողություն, սակայն նույն ընտանիքի miRNA-ների տարբերակման ազդեցությունը չպետք է լինի այնքան լավ, որքան ցողունային հանգույցի մեթոդը:Հակադարձ տառադարձման յուրաքանչյուր հավաքածու ունի պահանջներ գենային հատուկ պրայմերների (ցողունային հանգույցներ) կոնցենտրացիայի համար:Ներքին հղումը, որն օգտագործվում է miRNA-ի համար, U6 է:Ցողունային հանգույցի ինվերսիայի գործընթացում U6-ի խողովակը պետք է առանձին շրջվի, իսկ U6-ի առջևի և հետևի այբբենարանները պետք է ուղղակիորեն ավելացվեն:Ինչպես circRNA-ն, այնպես էլ lncRNA-ն կարող են օգտագործել HKG-ները որպես ներքին հղում:ՄեջcDNA հայտնաբերում,
եթե ՌՆԹ-ի հետ խնդիր չկա, cDNA-ն նույնպես պետք է լավ լինի:Այնուամենայնիվ, եթե փորձի կատարելությունը հետապնդվում է, ապա ավելի լավ է օգտագործել ներքին հղումային գեն (Reference gene, RG), որը կարող է տարբերակել gDNA-ն cds-ից:Ընդհանրապես, RG-ն տնային տնտեսության գեն է:, HKG), ինչպես ցույց է տրված Նկար 10-ում;Այդ ժամանակ ես պատրաստում էի սոյայի պահպանման սպիտակուցը և որպես ներքին հղում օգտագործեցի ակտին7 ինտրոններ պարունակող ակտին7:Այս այբբենարանի ուժեղացված հատվածի չափը gDNA-ում եղել է 452 bp, իսկ եթե cDNA-ն օգտագործվել է որպես ձևանմուշ, ապա այն կազմել է 142bp:Այնուհետև թեստի արդյունքները պարզեցին, որ cDNA-ի մի մասը իրականում աղտոտված է gDNA-ով, և այն նաև ապացուցեց, որ հակադարձ արտագրման արդյունքի հետ կապված խնդիր չկա, և այն կարող է օգտագործվել որպես PCR-ի ձևանմուշ:Անիմաստ է ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզն ուղղակիորեն cDNA-ով կատարելը, և դա ցրված ժապավեն է, որը համոզիչ չէ։

Նկար 10 cDNA հայտնաբերում

qPCR պայմանների որոշումըԸնդհանրապես խնդիր չկա, ըստ փաթեթի արձանագրության, հիմնականում tm արժեքի քայլում:Եթե ​​որոշ պրայմերներ լավ չեն նախագծված պրայմերների նախագծման ժամանակ, ինչը հանգեցնում է tm արժեքի և տեսական 60°C-ի միջև մեծ տարբերության, խորհուրդ է տրվում, որ cDNA-ն նմուշները խառնելուց հետո գրադիենտ PCR գործարկի պրայմերներով և փորձեք խուսափել ջերմաստիճանն առանց ժապավենների որպես TM արժեք սահմանելուց:

Տվյալների վերլուծություն

Սովորական հարաբերական ֆլուորեսցենտային քանակական PCR մշակման մեթոդը հիմնականում համաձայն 2-ΔΔCT.Տվյալների մշակման ձևանմուշ.

Առնչվող ապրանքներ.

Իրական ժամանակում PCR Հեշտ^TM -Թաքման

Իրական ժամանակում PCR Հեշտ^TM – ՍԻԲՐ ԳՐԻՆ Ի

RT Easy I (Master Premix առաջին շղթայի cDNA սինթեզի համար)

RT Easy II (Master Premix առաջին շղթայի cDNA սինթեզի համար qPCR-ի համար)