Որպես նոր լաբորատորիա, լավ գործ չէ դրական բույսերը զննել մի խումբ բույսերից, որոնք փոխակերպման ցածր մակարդակ ունեն:Նախ՝ մեծ թվով նմուշներից մեկ առ մեկ պետք է արդյունահանվի ԴՆԹ, ապա ՊՇՌ-ով կհայտնաբերվեն օտար գեները։Այնուամենայնիվ, արդյունքները հաճախ դատարկ են և երբեմն մի քանի տարրերով ժապավեններ, բայց անհնար է որոշել, թե արդյոք կան բաց թողնված կամ կեղծ հայտնաբերումներ:.Շա՞տ անօգնական է դիմակայել նման փորձարարական գործընթացին ու արդյունքներին։Մի անհանգստացեք, եղբայրը ձեզ սովորեցնում է, թե ինչպես հեշտությամբ և ճշգրիտ կերպով զննել տրանսգենային դրական բույսերը:

Քայլ 1

Դիզայնի հայտնաբերման այբբենարաններ

Որոշեք էնդոգեն գենը և էկզոգեն գենը, որը պետք է հայտնաբերվի ըստ փորձարկվող նմուշի, և ընտրեք ներկայացուցչական 100-500bp հաջորդականություն գենում պրայմերների ձևավորման համար:Լավ պրայմերները կարող են ապահովել հայտնաբերման արդյունքների ճշգրտությունը և կրճատել հայտնաբերման ժամանակը (տես հավելվածը սովորաբար օգտագործվող հայտնաբերման պրայմերների համար):

Ծանուցում. Նոր նախագծված այբբենարանները պետք է օպտիմալացնեն ռեակցիայի պայմանները և ստուգեն հայտնաբերման ճշգրտությունը, ճշգրտությունը և հայտնաբերման սահմանը, նախքան լայնածավալ հայտնաբերումը:

Քայլ 2

Դիզայն փորձարարական արձանագրություն

Դրական հսկողություն. Օգտագործեք մաքրված ԴՆԹ-ը, որը պարունակում է թիրախ բեկորը որպես ձևանմուշ՝ որոշելու, թե արդյոք PCR ռեակցիայի համակարգը և պայմանները նորմալ են:

Բացասական/դատարկ հսկողություն. Օգտագործեք ԴՆԹ-ի ձևանմուշը կամ ddH2O-ը, որը չի պարունակում թիրախային բեկորը որպես ձևանմուշ՝ PCR համակարգում աղտոտվածության աղբյուր հայտնաբերելու համար:

Ներքին հղումային հսկողություն. օգտագործեք փորձարկման ենթակա նմուշի էնդոգեն գենի պրայմեր/զոնդ համակցությունը՝ գնահատելու համար, թե արդյոք կաղապարը կարող է հայտնաբերվել PCR-ով:

Ծանուցում.

Փորձարարական արդյունքների վավերականությունը գնահատելու համար յուրաքանչյուր թեստի համար պետք է սահմանվեն դրական, բացասական/դատարկ հսկողություն և ներքին հսկողության հսկողություն:

Փորձի պատրաստում

Օգտագործելուց առաջ ուշադրություն դարձրեք, թե արդյոք լուծումը հավասարապես խառնված է:Եթե ​​տեղումներ են հայտնաբերվել, ապա օգտագործելուց առաջ դրանք պետք է լուծարվեն և խառնվեն ցուցումների համաձայն:2×PCR խառնուրդն օգտագործելուց առաջ պետք է մի քանի անգամ խառնել և խառնել միկրոպիպետով՝ իոնների անհավասար բաշխումից խուսափելու համար:

Ծանուցում.

Հանեք ձեռնարկը և ուշադիր կարդացեք այն, իսկ փորձից առաջ պատրաստվեք ձեռնարկի պահանջներին խիստ համապատասխան:

Քայլ 4

Պատրաստել PCR ռեակցիայի համակարգը

Ըստ փորձարարական արձանագրության՝ պրայմերները, H2O և 2×PCR խառնել հավասարաչափ, ցենտրիֆուգել և բաշխել դրանք յուրաքանչյուր ռեակցիայի խողովակի վրա:

Ծանուցում.

Լայնածավալ կամ երկարաժամկետ փորձարկման համար խորհուրդ է տրվում օգտագործել PCR ռեակցիայի համակարգ, որը պարունակում է UNG ֆերմենտ, որը կարող է արդյունավետորեն խուսափել PCR արտադրանքի պատճառով առաջացած աերոզոլային աղտոտումից:

Քայլ 5

Ավելացնել ռեակցիայի ձևանմուշ

Direct PCR տեխնոլոգիայի կիրառմամբ՝ նուկլեինաթթվի մաքրման հոգնեցուցիչ գործընթացի կարիք չկա, նմուշի ձևանմուշը կարող է պատրաստվել 10 րոպեի ընթացքում և կարող է ավելացվել համապատասխան PCR ռեակցիայի համակարգը:

Ծանուցում.

Պառակտման մեթոդը ավելի լավ հայտնաբերման ազդեցություն ունի, և ստացված արտադրանքը կարող է օգտագործվել բազմաթիվ հայտնաբերման ռեակցիաների համար:

5.1. Տերևների ուղղակի ընդլայնում

Ձեռնարկի նկարի չափի համաձայն՝ կտրատել 2-3մմ տրամագծով տերևային հյուսվածքը և տեղադրել PCR ռեակցիայի համակարգում։

Նշում. Համոզվեք, որ տերևի բեկորներն ամբողջությամբ ընկղմված են ՊՇՌ ռեակցիայի լուծույթի մեջ և ավելորդ տերևի հյուսվածք չավելացնել:

5.2. Տերևների պառակտման մեթոդ

Կտրեք տերևային հյուսվածքը 5-7 մմ տրամագծով և տեղադրեք ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ։Եթե ​​դուք ընտրում եք հասուն տերևներ, խնդրում ենք խուսափել տերևի հիմնական երակի հյուսվածքներից:50 մլ բուֆեր P1 լիզատը լցրեք ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, որպեսզի համոզվեք, որ լիզատը կարող է ամբողջությամբ ընկղմել տերևի հյուսվածքը, տեղադրել այն ջերմացիկլերի կամ մետաղական լոգանքի մեջ և լուծարել 95°C ջերմաստիճանում 5-10 րոպե:

Ավելացնել 50 ուլ բուֆեր P2 չեզոքացման լուծույթ և լավ խառնել:Ստացված լիզատը կարող է օգտագործվել որպես ձևանմուշ և ավելացվել PCR ռեակցիայի համակարգին:

Նշում. Կաղապարի քանակը PCR համակարգի 5-10%-ի միջև է և չպետք է գերազանցի 20%-ը (օրինակ, 20 μl PCR համակարգում ավելացրեք 1-2 մկլ լիզի լուծույթ, ոչ ավելի, քան 4 μl):

Քայլ 6

PCR ռեակցիա

PCR ռեակցիայի խողովակը ցենտրիֆուգելուց հետո այն տեղադրվում է PCR գործիքի մեջ ուժեղացման համար:

Ծանուցում.

Ռեակցիան ամպլիֆիկացիայի համար օգտագործում է չմաքրված կաղապար, ուստի ուժեղացման ցիկլերի թիվը 5-10 ցիկլով ավելի է, քան մաքրված ԴՆԹ-ի կաղապար օգտագործելիս:

Քայլ 7

Էլեկտրոֆորեզի հայտնաբերում և արդյունքների վերլուծություն

M: 100bp ԴՆԹ սանդուղք

1\4. Մաքրված ԴՆԹ մեթոդ

2\5. Ուղղակի ՊՇՌ մեթոդ

3\6՝ դատարկ հսկողություն

QC:

Փորձի մեջ սահմանված տարբեր հսկիչ սարքերի փորձարկման արդյունքները պետք է համապատասխանեն հետևյալ պայմաններին.Հակառակ դեպքում պետք է վերլուծել խնդրի պատճառը, և խնդիրը վերացնելուց հետո նորից կատարել թեստ։

Աղյուսակ 1. Տարբեր հսկիչ խմբերի նորմալ փորձարկման արդյունքներ

*Երբ պլազմիդն օգտագործվում է որպես դրական հսկողություն, էնդոգեն գենի թեստի արդյունքը կարող է բացասական լինել

Արդյունքի դատողություն.

Ա. Նմուշի էնդոգեն գենի փորձարկման արդյունքը բացասական է, ինչը ցույց է տալիս, որ սովորական PCR հայտնաբերման համար հարմար ԴՆԹ-ն չի կարող արդյունահանվել նմուշից կամ արդյունահանված ԴՆԹ-ն պարունակում է PCR ռեակցիայի արգելակիչներ, և ԴՆԹ-ն պետք է նորից արդյունահանվի:

Բ. Նմուշի էնդոգեն գենի փորձարկման արդյունքը դրական է, իսկ էկզոգեն գենի թեստի արդյունքը բացասական է, ինչը ցույց է տալիս, որ նմուշից դուրս է բերվել սովորական PCR հայտնաբերման համար հարմար ԴՆԹ, և կարելի է դատել, որ XXX գենը նմուշում չի հայտնաբերվել:

Գ. Նմուշի էնդոգեն գենի փորձարկման արդյունքը դրական է, իսկ էկզոգեն գենի թեստի արդյունքը դրական է, ինչը ցույց է տալիս, որ սովորական PCR հայտնաբերման համար հարմար ԴՆԹ-ն դուրս է բերվել նմուշից, և ԴՆԹ-ի նմուշը պարունակում է XXX գեն:Հաստատման փորձերը կարող են հետագայում իրականացվել:

Քայլ 8

Դիզայնի հայտնաբերման այբբենարաններ

Փորձարկումից հետո օգտագործեք նատրիումի հիպոքլորիտի 2% լուծույթ և 70% էթանոլի լուծույթ՝ փորձնական տարածքը մաքրելու համար՝ շրջակա միջավայրի աղտոտումը կանխելու համար։