Ընդհանուր ակնարկ
Տրանսգենային բույսերի արագ նույնականացում
Տեքստ/Tong Yucheng
Փորձարարական գործողություն/Հան Ին
Խմբագիր/Վեն Յուջուն
Բառեր/1600+
Ընթերցանության առաջարկվող ժամանակը/8-10 րոպե
Տրանսգենային բույսերի արագ նույնականացում
Լինելով լաբորատորիայում նորեկ, լավ գործ չէ դրական բույսերը զննել մի խումբ բույսերից ցածր փոխակերպման արագությամբ:Նախ՝ մեծ թվով նմուշներից մեկ առ մեկ պետք է արդյունահանվի ԴՆԹ, ապա ՊՇՌ-ով կհայտնաբերվեն օտար գեները։Այնուամենայնիվ, արդյունքները հաճախ դատարկ են և երբեմն մի քանի տարրերով ժապավեններ, բայց անհնար է որոշել, թե արդյոք կան բաց թողնված կամ կեղծ հայտնաբերումներ:.Շա՞տ անօգնական է դիմակայել նման փորձարարական գործընթացին ու արդյունքներին։Մի անհանգստացեք, եղբայրը ձեզ սովորեցնում է, թե ինչպես հեշտությամբ և ճշգրիտ կերպով զննել տրանսգենային դրական բույսերը:
Քայլ 1: Դիզայնի հայտնաբերման այբբենարաններ
Որոշեք էնդոգեն գենը և էկզոգեն գենը, որը պետք է հայտնաբերվի ըստ փորձարկվող նմուշի, և ընտրեք ներկայացուցչական 100-500bp հաջորդականություն գենում պրայմերների ձևավորման համար:Լավ պրայմերները կարող են ապահովել հայտնաբերման արդյունքների ճշգրտությունը և կրճատել հայտնաբերման ժամանակը (տես հավելվածը սովորաբար օգտագործվող հայտնաբերման պրայմերների համար):
Նշում:
Նոր նախագծված այբբենարանները պետք է օպտիմալացնեն ռեակցիայի պայմանները և ստուգեն հայտնաբերման ճշգրտությունը, ճշգրտությունը և հայտնաբերման սահմանը՝ նախքան լայնածավալ հայտնաբերում կատարելը:
Քայլ 2:Մշակել փորձարարական արձանագրություն
Դրական հսկողություն. Օգտագործեք մաքրված ԴՆԹ-ը, որը պարունակում է թիրախ բեկորը որպես ձևանմուշ՝ որոշելու, թե արդյոք PCR ռեակցիայի համակարգը և պայմանները նորմալ են:
Բացասական/դատարկ հսկողություն. Օգտագործեք ԴՆԹ կաղապար կամ ddH2O, որը չի պարունակում թիրախային բեկորը որպես ձևանմուշ՝ PCR համակարգում աղտոտման աղբյուր հայտնաբերելու համար:
Ներքին հղումային հսկողություն. օգտագործեք փորձարկման ենթակա նմուշի էնդոգեն գենի պրայմեր/զոնդ համակցությունը՝ գնահատելու համար, թե արդյոք կաղապարը կարող է հայտնաբերվել PCR-ով:
Նշում:
Փորձարարական արդյունքների վավերականությունը գնահատելու համար յուրաքանչյուր թեստի համար պետք է սահմանվեն դրական, բացասական/դատարկ հսկողություն և ներքին հսկողության հսկողություն:
Քայլ 3: Փորձի պատրաստում
Օգտագործելուց առաջ ուշադրություն դարձրեք, թե արդյոք լուծումը հավասարապես խառնված է:Եթե տեղումներ են հայտնաբերվել, ապա օգտագործելուց առաջ դրանք պետք է լուծարվեն և խառնվեն ցուցումների համաձայն:2×PCR խառնուրդն օգտագործելուց առաջ պետք է մի քանի անգամ խառնել և խառնել միկրոպիպետով՝ իոնների անհավասար բաշխումից խուսափելու համար:
Նշում:
Հանեք հրահանգները և ուշադիր կարդացեք դրանք, իսկ փորձից առաջ պատրաստվեք հրահանգներին խստորեն համապատասխան:
Քայլ 4. Պատրաստել PCR ռեակցիայի համակարգը
Ըստ փորձարարական արձանագրության՝ խառնել այբբենարանները, Հ2O, 2×PCR խառնել, ցենտրիֆուգել և տարածել դրանք յուրաքանչյուր ռեակցիայի խողովակի վրա:
Նշում:
Լայնածավալ կամ երկարաժամկետ փորձարկման համար խորհուրդ է տրվում օգտագործել PCR ռեակցիայի համակարգ, որը պարունակում է UNG ֆերմենտ, որը կարող է արդյունավետորեն խուսափել PCR արտադրանքի պատճառով առաջացած աերոզոլային աղտոտումից:
Քայլ 5. Ավելացնել ռեակցիայի ձևանմուշ
Օգտագործելով Direct PCR տեխնոլոգիան, կարիք չկա նուկլեինաթթվի մաքրման հոգնեցուցիչ գործընթացի:Նմուշի ձևանմուշը կարելի է պատրաստել 10 րոպեի ընթացքում և ավելացնել համապատասխան PCR ռեակցիայի համակարգին:
Նշում:
Լիզիս մեթոդն ունի ավելի լավ հայտնաբերման ազդեցություն, և ստացված արտադրանքը կարող է օգտագործվել բազմաթիվ հայտնաբերման ռեակցիաների համար:
5.1. Տերևների ուղղակի ՊՇՌ
Ձեռնարկի նկարի չափի համաձայն՝ կտրատել 2-3մմ տրամագծով տերևային հյուսվածքը և տեղադրել PCR ռեակցիայի համակարգում։
Նշում. Համոզվեք, որ տերևի բեկորներն ամբողջությամբ ընկղմված են ՊՇՌ ռեակցիայի լուծույթի մեջ և ավելորդ տերևի հյուսվածք չավելացնել:
5.2. Տերևի լիզի մեթոդ
Կտրեք տերևային հյուսվածքը 5-7 մմ տրամագծով և տեղադրեք ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ։Եթե դուք ընտրում եք հասուն տերևներ, խնդրում ենք խուսափել տերևի հիմնական երակի հյուսվածքներից:50 մլ բուֆեր P1 լիզատը լցրեք ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, որպեսզի համոզվեք, որ լիզատը կարող է ամբողջությամբ ընկղմել տերևի հյուսվածքը, տեղադրել այն ջերմացիկլերի կամ մետաղական լոգանքի մեջ և լուծարել 95°C ջերմաստիճանում 5-10 րոպե:
Ավելացնել 50 ուլ բուֆեր P2 չեզոքացման լուծույթ և լավ խառնել:Ստացված լիզատը կարող է օգտագործվել որպես ձևանմուշ և ավելացվել PCR ռեակցիայի համակարգին:
Նշում. Կաղապարի քանակը պետք է լինի PCR համակարգի 5-10%-ի սահմաններում և չպետք է գերազանցի 20%-ը (օրինակ, 20 μl PCR համակարգում ավելացրեք 1-2 մկլ լիզի բուֆեր, ոչ ավելի, քան 4 μl):
Քայլ 6. ՊՇՌ ռեակցիա
PCR ռեակցիայի խողովակը ցենտրիֆուգելուց հետո դրանք տեղադրեք PCR գործիքի մեջ ուժեղացման համար:
Նշում:
Ռեակցիան ամպլիֆիկացիայի համար օգտագործում է չմաքրված կաղապար, ուստի ուժեղացման ցիկլերի թիվը 5-10 ցիկլով ավելի է, քան մաքրված ԴՆԹ-ի կաղապար օգտագործելիս:
Քայլ 7. Էլեկտրոֆորեզի հայտնաբերում և արդյունքների վերլուծություն
M:100bp ԴՆԹ սանդուղք
1\4. Մաքրված ԴՆԹ մեթոդ
2\5. Ուղղակի ՊՇՌ մեթոդ
3\6՝ դատարկ հսկողություն
Որակի հսկողություն:
Փորձի մեջ սահմանված տարբեր հսկիչ սարքերի փորձարկման արդյունքները պետք է համապատասխանեն հետևյալ պայմաններին.Հակառակ դեպքում պետք է վերլուծել խնդրի պատճառը, և խնդիրը վերացնելուց հետո նորից կատարել թեստ։
Աղյուսակ 1. Տարբեր հսկիչ խմբերի նորմալ փորձարկման արդյունքներ
*Երբ պլազմիդն օգտագործվում է որպես դրական հսկողություն, էնդոգեն գենի թեստի արդյունքը կարող է բացասական լինել
Արդյունքի դատողություն.
Ա. Նմուշի էնդոգեն գենի փորձարկման արդյունքը բացասական է, ինչը ցույց է տալիս, որ սովորական PCR հայտնաբերման համար հարմար ԴՆԹ-ն չի կարող արդյունահանվել նմուշից կամ արդյունահանված ԴՆԹ-ն պարունակում է PCR ռեակցիայի արգելակիչներ, և ԴՆԹ-ն պետք է նորից արդյունահանվի:
Բ. Նմուշի էնդոգեն գենի փորձարկման արդյունքը դրական է, իսկ էկզոգեն գենի թեստի արդյունքը բացասական է, ինչը ցույց է տալիս, որ սովորական PCR հայտնաբերման համար հարմար ԴՆԹ-ն դուրս է բերվել նմուշից, և կարելի է դատել, որ XXX գենը նմուշում չի հայտնաբերվել:
Գ. Նմուշի էնդոգեն գենի փորձարկման արդյունքը դրական է, իսկ էկզոգեն գենի թեստի արդյունքը դրական է, ինչը ցույց է տալիս, որ սովորական PCR հայտնաբերման համար հարմար ԴՆԹ-ն դուրս է բերվել նմուշից, և ԴՆԹ-ի նմուշը պարունակում է XXX գեն:Հաստատման փորձերը կարող են հետագայում իրականացվել:
Քայլ 8. Դիզայնի հայտնաբերման այբբենարաններ
Փորձից հետո օգտագործեք նատրիումի հիպոքլորիտի 2% լուծույթ և 70% էթանոլի լուծույթ՝ փորձնական տարածքը մաքրելու համար՝ շրջակա միջավայրի աղտոտումը կանխելու համար:
Հավելված
Աղյուսակ 2. Գենետիկորեն ձևափոխված բույսերի ընդհանուր PCR հայտնաբերման համար սովորաբար օգտագործվող պրայմերներ
Հղման փաստաթուղթ.
SN/T 1202-2010, Սննդի մեջ գենետիկորեն ձևափոխված բույսերի բաղադրիչների որակական PCR հայտնաբերման մեթոդ:
Գյուղատնտեսության նախարարության հայտարարություն 1485-5-2010, Գենետիկորեն ձևափոխված բույսերի և դրանց արտադրանքի բաղադրիչների փորձարկում՝ բրինձ M12 և դրա ածանցյալները:
Հրապարակման ժամանակը՝ հունիս-09-2021
