一、 Բարձրացնել ռեակցիայի համակարգի զգայունությունը

1. Մեկուսացնել բարձրորակ ՌՆԹ:

cDNA-ի հաջող սինթեզը գալիս է բարձրորակ ՌՆԹ-ից:Բարձրորակ ՌՆԹ-ն պետք է լինի առնվազն ամբողջ երկարությամբ և զերծ հակադարձ տրանսկրիպտազի ինհիբիտորներից, ինչպիսիք են EDTA-ն կամ SDS-ը:ՌՆԹ-ի որակը որոշում է հաջորդականության տեղեկատվության առավելագույն քանակը, որը դուք կարող եք արտագրել cDNA-ի:ՌՆԹ-ի մաքրման ընդհանուր մեթոդը մեկ քայլ մեթոդ է, որն օգտագործում է գուանիդին իզոթիոցիանատ/թթվային ֆենոլ:RNase-ի հետքերով աղտոտումը կանխելու համար ՌՆԱզով հարուստ նմուշներից (օրինակ՝ ենթաստամոքսային գեղձի) մեկուսացված ՌՆԹ-ն պետք է պահվի ֆորմալդեհիդում՝ բարձրորակ ՌՆԹ-ն պահպանելու համար, հատկապես երկարաժամկետ պահպանման համար:Առնետների լյարդից արդյունահանվող ՌՆԹ-ն հիմնականում քայքայվել է՝ մեկ շաբաթ ջրի մեջ պահելուց հետո, մինչդեռ առնետի փայծաղից արդյունահանված ՌՆԹ-ն 3 տարի ջրի մեջ պահելուց հետո մնացել է կայուն:Բացի այդ, 4 կբ-ից երկար տառադարձումները ավելի զգայուն են հետագծային RNase-ների դեգրադացիայի նկատմամբ, քան փոքր տառադարձումները:Պահպանված ՌՆԹ-ի նմուշների կայունությունը բարձրացնելու համար ՌՆԹ-ն կարող է լուծվել դեիոնացված ֆորմամիդի մեջ և պահել -70°C-ում:ՌՆԹ-ի պահպանման համար օգտագործվող ֆորմամիդը պետք է զերծ լինի ՌՆԹ-ն քայքայող բեկորներից:Ենթաստամոքսային գեղձի ՌՆԹ-ն կարող է պահպանվել ֆորմամիդի մեջ առնվազն մեկ տարի:ՌՆԹ-ի օգտագործմանը նախապատրաստվելիս ՌՆԹ-ն նստեցնելու համար կարող եք օգտագործել հետևյալ մեթոդը՝ NaCl ավելացնել 0,2 մ և 4 անգամ ավելի էթանոլի ծավալին, տեղադրել սենյակային ջերմաստիճանում 3-5 րոպե և ցենտրիֆուգել 10000×g 5 րոպե:

2. Օգտագործեք RNaseH-ոչ ակտիվ (RNaseH-) հակադարձ տրանսկրիպտազը:

RNase ինհիբիտորները հաճախ ավելացվում են հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիաներին՝ cDNA-ի սինթեզի երկարությունը և ելքը մեծացնելու համար:RNase ինհիբիտորները պետք է ավելացվեն առաջին շղթայի սինթեզի ռեակցիայի ժամանակ՝ բուֆերի և վերականգնող նյութի (օրինակ՝ DTT) առկայության դեպքում, քանի որ cDNA-ի սինթեզին նախորդող գործընթացը դենատուրատոր է դարձնում արգելակիչը՝ դրանով իսկ ազատելով կապված RNase, որը կարող է քայքայել ՌՆԹ-ն:Սպիտակուցի RNase ինհիբիտորները կանխում են միայն RNase-ի քայքայումը RNase A, B, C-ով և չեն կանխում RNase-ը մաշկի վրա, այնպես որ զգույշ եղեք, որ ձեր մատներից RNase չներմուծեք՝ չնայած այս ինհիբիտորների օգտագործմանը:

Հակադարձ տրանսկրիպտազը կատալիզացնում է ՌՆԹ-ի փոխակերպումը cDNA-ի:Ե՛վ M-MLV-ն, և՛ AMV-ն ունեն էնդոգեն RNaseH ակտիվություն՝ ի լրումն իրենց սեփական պոլիմերազային ակտիվության:RNaseH-ի ակտիվությունը և պոլիմերազային ակտիվությունը մրցակցում են միմյանց հետ ՌՆԹ կաղապարի և ԴՆԹ պրիմերի կամ cDNA ընդլայնման շղթայի միջև ձևավորված հիբրիդային շղթայի համար և քայքայում են ՌՆԹ-ի շարանը ՌՆԹ:ԴՆԹ համալիրում:RNaseH-ի ակտիվությամբ քայքայված ՌՆԹ կաղապարն այլևս չի կարող ծառայել որպես cDNA սինթեզի արդյունավետ սուբստրատ, ինչը նվազեցնում է cDNA-ի սինթեզի արդյունքը և երկարությունը:Հետևաբար, օգտակար կլինի վերացնել կամ զգալիորեն նվազեցնել հակադարձ տրանսկրիպտազի RNaseH ակտիվությունը։

SuperScript Ⅱ հակադարձ տրանսկրիպտազը, RNaseH- MMLV հակադարձ տրանսկրիպտազը և thermoScript հակադարձ տրանսկրիպտազը, RNaseH- AMV, կարող են ավելի շատ քանակություն և ավելի ամբողջական cDNA ստանալ, քան MMLV-ն և AMV-ն:RT-PCR զգայունության վրա կազդի cDNA սինթեզի քանակությունը:ThermoScript-ը շատ ավելի զգայուն է, քան AMV-ն:RT-PCR արտադրանքի չափը սահմանափակվում է հակադարձ տրանսկրիպտազի՝ cDNA սինթեզելու ունակությամբ, հատկապես ավելի մեծ cDNA-ների կլոնավորման ժամանակ:Համեմատած MMLV-ի հետ՝ SuperScripⅡ զգալիորեն ավելացրել է երկարատև RT-PCR արտադրանքի եկամտաբերությունը:RNaseH- հակադարձ տրանսկրիպտազը նույնպես բարձրացրել է ջերմակայունությունը, ուստի ռեակցիան կարող է իրականացվել նորմալ 37-42°C-ից բարձր ջերմաստիճանում:Առաջարկվող սինթեզի պայմաններում օգտագործեք օլիգո(dT) այբբենարան և 10 μCi [α-P]dCTP:Առաջին շղթայի ընդհանուր եկամտաբերությունը հաշվարկվել է TCA տեղումների մեթոդով:Ամբողջական cDNA-ն վերլուծվել է՝ օգտագործելով չափի տեսակավորված ժապավեններ, որոնք կտրված են և հաշվվում են ալկալային ագարոզայի գելի վրա:

3. Բարձրացրեք ինկուբացիոն ջերմաստիճանը հակադարձ արտագրման համար.

Ավելի բարձր ինկուբացիոն ջերմաստիճանն օգնում է բացել ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը՝ մեծացնելով ռեակցիայի ելքը։ՌՆԹ-ի ձևանմուշների մեծ մասի համար ՌՆԹ-ի և պրայմերների ինկուբացիա 65°C-ում առանց բուֆերի կամ աղի, որին հաջորդում է սառույցի վրա արագ սառեցումը, կվերացնի երկրորդական կառուցվածքների մեծ մասը և թույլ կտա պրայմերներին միանալ:Այնուամենայնիվ, որոշ կաղապարներ դեռևս ունեն երկրորդական կառուցվածքներ, նույնիսկ ջերմային դենատուրացիայից հետո:Այս բարդ ձևանմուշների ուժեղացումը կարող է իրականացվել ThermoScript Reverse Transcriptase-ի միջոցով և հակադարձ տառադարձման ռեակցիան ավելի բարձր ջերմաստիճանում դնելով՝ ուժեղացումը բարելավելու համար:Ավելի բարձր ինկուբացիոն ջերմաստիճանները կարող են նաև բարձրացնել յուրահատկությունը, հատկապես, երբ cDNA-ի սինթեզի համար օգտագործվում են գենային հատուկ պրայմերներ (GSP) (տես Գլուխ 3):Եթե ​​օգտագործում եք GSP, համոզվեք, որ պրայմերների Tm-ը նույնն է, ինչ ակնկալվող ինկուբացիոն ջերմաստիճանը:Մի օգտագործեք օլիգո(dT) և պատահական պրայմերներ 60°C-ից բարձր:Պատահական այբբենարանները պահանջում են ինկուբացիա 25°C-ում 10 րոպե, նախքան 60°C-ի բարձրացումը:Հակադարձ տառադարձման ավելի բարձր ջերմաստիճան օգտագործելուց բացի, առանձնահատկությունը կարող է նաև բարելավվել՝ ՌՆԹ/պրայմեր խառնուրդն ուղղակիորեն տեղափոխելով 65°C դենատուրացիայի ջերմաստիճանից դեպի հակադարձ տառադարձման ինկուբացիոն ջերմաստիճան և ավելացնելով նախապես տաքացված 2× ռեակցիայի խառնուրդ (cDNA տաք մեկնարկի սինթեզ):Այս մոտեցումն օգնում է կանխել միջմոլեկուլային հիմքերի զուգավորումը, որը տեղի է ունենում ավելի ցածր ջերմաստիճաններում:RT-PCR-ի համար պահանջվող ջերմաստիճանի բազմակի փոխարկումը կարող է պարզեցվել՝ օգտագործելով ջերմային ցիկլեր:

Tth ջերմակայուն պոլիմերազը գործում է որպես ԴՆԹ պոլիմերազ Mg2+-ի և որպես ՌՆԹ պոլիմերազ Mn2+-ի առկայության դեպքում։Այն կարելի է տաք պահել առավելագույնը 65°C ջերմաստիճանում։Այնուամենայնիվ, PCR-ի ժամանակ Mn2+-ի առկայությունը նվազեցնում է հավատարմությունը, ինչը Tth պոլիմերազին դարձնում է ավելի քիչ հարմար բարձր ճշգրտության ուժեղացման համար, ինչպիսին է cDNA-ի կլոնավորումը:Բացի այդ, Tth-ն ունի հակադարձ տրանսկրիպցիայի ցածր արդյունավետություն, ինչը նվազեցնում է զգայունությունը, և քանի որ հակադարձ տրանսկրիպցիան և ՊՇՌ-ն կարող են իրականացվել մեկ ֆերմենտի միջոցով, առանց հակադարձ տրանսկրիպցիայի հսկիչ ռեակցիաները չեն կարող օգտագործվել cDNA-ի ուժեղացման արտադրանքները գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտող հետ համեմատելու համար:Առանձնացվել են ուժեղացման արտադրանքները:

4. Հավելումներ, որոնք նպաստում են հակադարձ տառադարձմանը.

Առաջին շղթայի սինթեզի ռեակցիային ավելացվում են հավելումներ, այդ թվում՝ գլիցերին և DMSO, որոնք կարող են նվազեցնել նուկլեինաթթվի կրկնակի շղթայի կայունությունը և արձակել ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը:Կարող է ավելացվել մինչև 20% գլիցերին կամ 10% DMSO՝ առանց SuperScript II-ի կամ MMLV-ի գործունեության վրա ազդելու:AMV-ն կարող է նաև հանդուրժել մինչև 20% գլիցերին՝ առանց ակտիվության կորստի:SuperScriptⅡ հակադարձ արտագրման ռեակցիայում RT-PCR-ի զգայունությունը առավելագույնի հասցնելու համար 10% գլիցերին կարող է ավելացվել և ինկուբացվել 45°C-ում:Եթե ​​PCR-ին ավելացվում է հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիայի արտադրանքի 1/10-ը, ապա ուժեղացման ռեակցիայում գլիցերինի կոնցենտրացիան կազմում է 0,4%, ինչը բավարար չէ PCR-ն արգելակելու համար։

5. RNaseH բուժում.

cDNA-ի սինթեզի ռեակցիաների բուժումը RNaseH-ով PCR-ից առաջ կարող է մեծացնել զգայունությունը:Որոշ ձևանմուշների համար ենթադրվում է, որ ՌՆԹ-ն cDNA-ի սինթեզի ռեակցիայում կանխում է ուժեղացման արտադրանքների կապը, որի դեպքում RNaseH բուժումը կարող է մեծացնել զգայունությունը:Ընդհանրապես, RNaseH բուժումն անհրաժեշտ է, երբ ուժեղացնում են ավելի երկար, ամբողջական երկարությամբ cDNA թիրախային ձևանմուշները, ինչպիսիք են ցածր պատճենի տուբերոզ սքերոզ II-ը:Այս դժվար ձևանմուշի համար RNaseH բուժումը ուժեղացրել է SuperScript II-ի կամ AMV սինթեզված cDNA-ի կողմից արտադրվող ազդանշանը:RT-PCR ռեակցիաների մեծամասնության համար RNaseH բուժումը կամընտիր է, քանի որ 95°C ջերմաստիճանում PCR-ի դենատուրացիան սովորաբար հիդրոլիզացնում է ՌՆԹ-ն ՌՆԹ:ԴՆԹ համալիրում:

6. Փոքր ՌՆԹ-ի հայտնաբերման մեթոդի բարելավում.

RT-PCR-ն հատկապես դժվար է, երբ հասանելի են միայն փոքր քանակությամբ ՌՆԹ:ՌՆԹ-ի մեկուսացման ժամանակ որպես կրող ավելացված գլիկոգեն օգնում է մեծացնել փոքր նմուշների բերքատվությունը:RNase-ազատ գլիկոգենը կարող է ավելացվել Trizol-ի ավելացման հետ միաժամանակ:Գլիկոգենը ջրում լուծվող է և կարող է պահպանվել ջրային փուլում ՌՆԹ-ի հետ՝ նպաստելու հետագա տեղումներին:50 մգ-ից պակաս հյուսվածքի կամ 106 մշակված բջիջների համար RNase-ից ազատ գլիկոգենի առաջարկվող կոնցենտրացիան 250 մկգ/մլ է:

SuperScript II-ի օգտագործմամբ հակադարձ արտագրման ռեակցիային ացետիլացված BSA ավելացնելը կարող է մեծացնել զգայունությունը, իսկ փոքր քանակությամբ ՌՆԹ-ի դեպքում՝ նվազեցնելով SuperScript II-ի քանակը և 40 միավոր RNaseOut նուկլեազի ինհիբիտորի ավելացումը կարող է բարձրացնել հայտնաբերման մակարդակը:Եթե ​​գլիկոգենն օգտագործվում է ՌՆԹ-ի մեկուսացման գործընթացում, այնուամենայնիվ, խորհուրդ է տրվում ավելացնել BSA կամ RNase ինհիբիտոր, երբ օգտագործվում է SuperScript II հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիայի համար:

二、 Բարձրացնել RT-PCR առանձնահատկությունը

1. CND ասինթեզ:

Առաջին շղթայի cDNA-ի սինթեզը կարող է սկսվել՝ օգտագործելով երեք տարբեր մեթոդներ, որոնց հարաբերական առանձնահատկությունն ազդում է սինթեզված cDNA-ի քանակի և տեսակի վրա:

Պատահական այբբենարանի մեթոդը երեք մեթոդներից ամենաքիչն էր:Այբբենարանները կռվում են բազմաթիվ տեղամասերում ամբողջ տառադարձման ընթացքում՝ առաջացնելով կարճ, մասնակի երկարությամբ cDNA-ներ:Այս մեթոդը հաճախ օգտագործվում է 5' վերջի հաջորդականություններ ստանալու և ՌՆԹ կաղապարներից cDNA ստանալու համար, որոնք ունեն երկրորդական կառուցվածքի շրջաններ կամ վերջնակետեր, որոնք չեն կարող վերարտադրվել հակադարձ տրանսկրիպտազի միջոցով:Ամենաերկար cDNA-ն ստանալու համար ՌՆԹ-ի յուրաքանչյուր նմուշում պրայմերների և ՌՆԹ-ի հարաբերակցությունը պետք է էմպիրիկորեն որոշվի:Պատահական պրայմերների մեկնարկային կոնցենտրացիան տատանվում էր 50-ից մինչև 250 նգ 20 մկլ ռեակցիայի համար:Քանի որ ընդհանուր ՌՆԹ-ից սինթեզված cDNA-ն, օգտագործելով պատահական պրայմերներ, հիմնականում ռիբոսոմային ՌՆԹ է, որպես ձևանմուշ սովորաբար ընտրվում է պոլի(Ա)+ՌՆԹ:

Oligo(dT) այբբենարաններն ավելի կոնկրետ են, քան պատահական այբբենարանները:Այն հիբրիդացվում է էուկարիոտիկ mRNA-ների մեծ մասի 3' վերջում հայտնաբերված պոլի(A) պոչին:Քանի որ poly(A)+ ՌՆԹ-ն կազմում է ընդհանուր ՌՆԹ-ի մոտավորապես 1%-ից 2%-ը, cDNA-ի քանակն ու բարդությունը շատ ավելի քիչ է, քան պատահական պրայմերների դեպքում:Իր բարձր յուրահատկության պատճառով օլիգո(dT) սովորաբար չի պահանջում ՌՆԹ-ի և պրայմերների հարաբերակցության օպտիմալացում և պոլի(A)+ ընտրություն:Խորհուրդ է տրվում օգտագործել 0,5 մկգ օլիգո(dT) 20 մկլ ռեակցիայի համակարգում:oligo(dT)12-18-ը հարմար է RT-PCR-ի մեծ մասի համար:ThermoScript RT-PCR համակարգը առաջարկում է օլիգո(dT)20՝ ավելի լավ ջերմային կայունության պատճառով ինկուբացիոն ավելի բարձր ջերմաստիճանների համար:

Գենային հատուկ այբբենարանները (GSP) հակադարձ տրանսկրիպցիայի փուլի ամենասպեցիֆիկ այբբենարաններն են:GSP-ն հակասիտային օլիգոնուկլեոտիդ է, որը կարող է հատուկ հիբրիդացվել ՌՆԹ-ի թիրախային հաջորդականության հետ՝ ի տարբերություն պատահական պրայմերների կամ օլիգո(dT), որոնք միանում են բոլոր ՌՆԹ-ներին:Նույն կանոնները, որոնք օգտագործվում են PCR պրայմերների նախագծման համար, կիրառվում են հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիաներում GSP-ի նախագծման համար:GSP-ն կարող է լինել նույն հաջորդականությունը, ինչ ամպլիֆիկացման այբբենարանը, որը կռում է mRNA-ի 3'-ամենա ծայրին, կամ GSP-ն կարող է նախագծվել հակադարձ ուժեղացման այբբենարանից ներքև թրծելու համար:Որոշ ուժեղացված առարկաների համար անհրաժեշտ է նախագծել մեկից ավելի հակազգայուն այբբենարան հաջող RT-PCR-ի համար, քանի որ թիրախ ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը կարող է կանխել այբբենարանի կապը:Խորհուրդ է տրվում օգտագործել 1 pmol antisense GSP 20 μl առաջին շղթայի սինթեզի ռեակցիայի մեջ:

2. Բարձրացրեք ինկուբացիոն ջերմաստիճանը հակադարձ արտագրման համար.

GSP-ի առանձնահատկությունների լիարժեք առավելությունից լիարժեք օգտվելու համար պետք է օգտագործվի ավելի բարձր ջերմակայունությամբ հակադարձ տրանսկրիպտազ:Ջերմակայուն հակադարձ տրանսկրիպտազները կարող են ինկուբացվել ավելի բարձր ջերմաստիճաններում՝ բարձրացնելու ռեակցիայի խստությունը:Օրինակ, եթե GSP-ն եփում է 55°C-ում, GSP-ի առանձնահատկությունն ամբողջությամբ չի օգտագործվի, եթե AMV-ն կամ M-MLV-ն օգտագործվում են հակադարձ տառադարձման համար 37°C ցածր խստությամբ:Այնուամենայնիվ, SuperScript II-ը և ThermoScript-ը կարող են արձագանքվել 50°C կամ ավելի բարձր ջերմաստիճանում, ինչը կվերացնի ավելի ցածր ջերմաստիճանում առաջացած ոչ հատուկ արտադրանքները:Առավելագույն յուրահատկության համար ՌՆԹ/պրայմեր խառնուրդը կարող է ուղղակիորեն տեղափոխվել 65°C դենատուրացիայի ջերմաստիճանից դեպի հակադարձ տրանսկրիպցիոն ինկուբացիոն ջերմաստիճան և ավելացնել նախապես տաքացված 2× ռեակցիայի խառնուրդին (cDNA սինթեզի տաք սկիզբ):Սա օգնում է կանխել միջմոլեկուլային հիմքերի զուգավորումը ցածր ջերմաստիճաններում:RT-PCR-ի համար պահանջվող մի քանի ջերմաստիճանի անցումները կարող են պարզեցվել՝ օգտագործելով ջերմային ցիկլեր:

3. Նվազեցնում է գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտումը.

RT-PCR-ի հետ հանդիպող հնարավոր դժվարությունը ՌՆԹ-ում գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտումն է:ՌՆԹ-ի մեկուսացման լավ մեթոդի կիրառումը, ինչպիսին է Տրիզոլ ռեագենտը, կնվազեցնի գենոմային ԴՆԹ-ի քանակը, որն աղտոտում է ՌՆԹ-ի պատրաստումը:Գենոմային ԴՆԹ-ից ստացված արտադրանքներից խուսափելու համար ՌՆԹ-ն կարող է մշակվել ուժեղացման աստիճանի DNase I-ով, որպեսզի հեռացվի աղտոտող ԴՆԹ-ն՝ նախքան հակադարձ տրանսկրիպցիան:DNase I-ի մարսումն ավարտվեց՝ նմուշները ինկուբացնելով 2.0 մՄ EDTA-ում 10 րոպե 65°C-ում:EDTA-ն կարող է քելաթել մագնեզիումի իոնները՝ կանխելով մագնեզիումի իոնից կախված ՌՆԹ հիդրոլիզը բարձր ջերմաստիճաններում։

Ամրապնդված cDNA-ն գենոմային ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիոն արտադրանքներից աղտոտող նյութերից առանձնացնելու համար կարող են նախագծվել պրայմերներ, որոնցից յուրաքանչյուրը կռում է էկզոնների առանձին:cDNA-ից ստացված PCR արտադրանքներն ավելի կարճ կլինեն, քան աղտոտված գենոմային ԴՆԹ-ից ստացվածները:Բացի այդ, յուրաքանչյուր ՌՆԹ կաղապարի վրա իրականացվել է հսկիչ փորձ՝ առանց հակադարձ տառադարձման՝ որոշելու, թե արդյոք տվյալ հատվածը ստացվել է գենոմային ԴՆԹ-ից կամ cDNA-ից:Առանց հակադարձ տրանսկրիպցիայի ստացված PCR արտադրանքը ստացվում է գենոմից: