Ⅰ. Բարձրացնել ռեակցիայի համակարգի զգայունությունը.

1. Առանձին բարձրորակ ՌՆԹ.

cDNA-ի հաջող սինթեզը գալիս է բարձրորակ ՌՆԹ-ից:Բարձրորակ ՌՆԹ-ն պետք է ապահովի առնվազն ընդհանուր երկարություն և չի պարունակում ինհիբիտորներ, որոնք չեն պարունակում ձայնագրող ֆերմենտներ, ինչպիսիք են EDTA կամ SDS:ՌՆԹ-ի որակը որոշում է հաջորդականության տեղեկատվության առավելագույն արժեքը, որը դուք կարող եք արտագրել cDNA-ին:ՌՆԹ-ի ընդհանուր մաքրման մեթոդը isoocyanate/acidophenol-ի օգտագործման փուլային մեթոդ է:RNase-ի աղտոտումը կանխելու համար ՌՆԱզի (օրինակ՝ ենթաստամոքսային գեղձի) հարուստ նմուշից առանձնացված ՌՆԹ-ն պահանջում է ֆորմալդեհիդի պահեստավորում՝ բարձրորակ ՌՆԹ-ն խնայելու համար, ինչը ավելի շատ է երկարաժամկետ պահպանման դեպքում:Առնետների լյարդից արդյունահանվող ՌՆԹ-ն հիմնականում քայքայվել է մեկ շաբաթ ջրում պահելուց հետո, մինչդեռ առնետի փայծաղից արդյունահանված ՌՆԹ-ն մնացել է կայուն երեք տարի ջրում պահելուց հետո:Բացի այդ, 4 կբ-ից մեծ տառադարձումները ավելի զգայուն են RNase-ի քայքայման նկատմամբ, քան փոքր տառադարձումները:Պահպանվող ՌՆԹ-ի նմուշի կայունությունը բարձրացնելու համար ՌՆԹ-ն կարող է լուծվել իոնային մեթալմամինի մեջ և պահպանվել -70 °C:ՌՆԹ-ն փրկելու համար օգտագործվող թիլիդը չպետք է պարունակի տարբեր առարկաներ, որոնք քայքայում են ՌՆԹ-ն:ՌՆԹ-ն, որը ստացվում է ենթաստամոքսային գեղձից, կարելի է պահպանել մեթալմամինում առնվազն մեկ տարի:Երբ պատրաստ լինեք օգտագործել ՌՆԹ, կարող եք օգտագործել ՌՆԹ-ն նստեցնելու հետևյալ մեթոդները՝ NaCl ավելացնել 0,2 մ և 4 անգամ ավելի էթանոլի ծավալին, սենյակային ջերմաստիճանը դնել 3-5 րոպե և 10000 × գ կենտրոնախույս 5 րոպե:

2. Օգտագործեք հակադարձ տրանսկրիպտազ առանց RNaseH ակտիվության (RNaseH-):

RNase ինհիբիտորները հաճախ ավելացվում են հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիաներին՝ cDNA-ի սինթեզի երկարությունը և ելքը մեծացնելու համար:RNase ինհիբիտորն ավելացվում է առաջին շղթայական սինթեզի ռեակցիայի մեջ բուֆերների և նվազեցնող նյութերի առկայության դեպքում, ինչպիսին է DTT-ն, քանի որ մինչ cDNA-ի սինթեզի գործընթացը դենատուրացիա է անում արգելակիչին՝ դրանով իսկ ազատելով կապված RNase-ներ, որոնք քայքայում են ՌՆԹ-ն:Սպիտակուցի RNase-ի ինհիբիտորը միայն կանխում է ՌՆԹ-ի քայքայումը RNase A, B, C-ով և չի կանխում RNase-ները մաշկի վրա, ուստի պետք է զգուշանալ, որ RNase-ները չներմուծվեն մատներից՝ չնայած այս ինհիբիտորների օգտագործմանը:

Հակադարձ տրանսկրիպտազը կատալիզացնում է ՌՆԹ-ի փոխակերպումը cDNA-ի:Ե՛վ M-MLV-ն, և՛ AMV-ն ունեն էնդոգեն RNaseH ակտիվություն՝ ի լրումն իրենց սեփական պոլիմերազային ակտիվության:RNaseH-ի ակտիվությունը մրցակցում է պոլիմերազային ակտիվության հետ ՌՆԹ կաղապարների և ԴՆԹ պրայմերների կամ cDNA ընդլայնման շղթաների միջև ձևավորված հետերոզիգոտ շղթաների հետ և քայքայում է ՌՆԹ-ն՝ ՌՆԹ-ի շղթաները ԴՆԹ-ի համալիրներում:RNaseH-ի ակտիվությամբ քայքայված ՌՆԹ կաղապարներն այլևս չեն կարող օգտագործվել որպես cDNA սինթեզի արդյունավետ սուբստրատներ՝ նվազեցնելով cDNA-ի սինթեզի արդյունքը և երկարությունը:Այսպիսով, հակադարձ տրանսկրիպտազի RNaseH ակտիվության վերացումը կամ մեծապես նվազեցնելը մեծ օգուտ կբերի:

SuperScriptⅡ հակադարձ տրանսկրիպտազը, MMLV հակադարձ տրանսկրիպտազը RNaseH- և thermoScript հակադարձ տրանսկրիպտազը, AMV-ն RNaseH-ը տվել են ավելի ամբողջական երկարությամբ cDNA, քան MMLV-ն և AMV-ն:RT-PCR զգայունության վրա ազդում է սինթեզված cDNA-ի քանակությունը:ThermoScript-ը շատ ավելի զգայուն է, քան AMV-ն:RT-PCR արտադրանքի չափը սահմանափակված է հակադարձ տրանսկրիպտազի՝ cDNA սինթեզելու ունակությամբ, հատկապես ավելի մեծ Cdna-ների կլոնավորման ժամանակ:Համեմատած MMLV-ի հետ՝ SuperScripⅡ զգալիորեն ավելացրել է երկարատև RT-PCR արտադրանքի եկամտաբերությունը:RNaseH-ի հակադարձ տրանսկրիպտազը նույնպես մեծացնում է ջերմային կայունությունը, ուստի ռեակցիան կարող է իրականացվել 37-42℃ նորմայից բարձր ջերմաստիճանում:Առաջարկվող սինթեզի պայմաններում օգտագործվել են օլիգո(dT) պրայմերներ և 10μCi [alpha-p]dCTP:Առաջին շղթայի ընդհանուր արտադրությունը հաշվարկվել է TCA տեղումների մեթոդով:Ամբողջական cDNA-ն վերլուծվել է՝ օգտագործելով չափի տեսակավորված շերտի հեռացում և հաշվում ալկալային ագարոզայի գելի մեջ:

3. Բարձրացնել հակադարձ արտագրման ջերմության պահպանման ջերմաստիճանը.

Պահման ավելի բարձր ջերմաստիճանն օգնում է բացել ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը և մեծացնել ռեակցիայի ելքը:ՌՆԹ-ի ձևանմուշների մեծ մասի համար ՌՆԹ-ն և այբբենարանը 65°C-ում պահելը առանց բուֆերի կամ աղի, այնուհետև սառույցի վրա արագ սառեցնելը վերացնում է երկրորդական կառուցվածքների մեծ մասը և թույլ է տալիս այբբենարաններին միանալ:Այնուամենայնիվ, որոշ կաղապարներ դեռևս ունեն երկրորդական կառուցվածք, նույնիսկ ջերմային դենատուրացիայից հետո:Այս բարդ ձևանմուշների ուժեղացումը կարող է իրականացվել ThermoScript հակադարձ տրանսկրիպտազի միջոցով և հակադարձ տրանսկրիպտազի ռեակցիան ավելի բարձր ջերմաստիճանում դնելով ուժեղացումը բարելավելու համար:Պահման ավելի բարձր ջերմաստիճանները կարող են նաև բարձրացնել յուրահատկությունը, հատկապես, երբ cDNA սինթեզն իրականացվում է գենային հատուկ պրայմերների (GSPS) միջոցով (տես Գլուխ 3):Եթե ​​օգտագործում եք GSP, համոզվեք, որ այբբենարանի Tm արժեքը նույնն է, ինչ սպասվող պահպանման ջերմաստիճանը:Մի օգտագործեք օլիգո(dT) և պատահական պրայմերներ 60℃-ից բարձր:Պատահական այբբենարանները պետք է պահել 25℃ ջերմաստիճանում 10 րոպե՝ մինչև 60℃ բարձրացնելը:Հակադարձ տառադարձման ավելի բարձր ջերմաստիճաններ օգտագործելուց բացի, առանձնահատկությունը կարող է բարելավվել՝ ՌՆԹ/ այբբենարանի խառնուրդն ուղղակիորեն փոխանցելով 65℃ դենատուրացնող ջերմաստիճանից հակադարձ տառադարձման պահպանման ջերմաստիճանին և ավելացնելով նախապես տաքացված 2× ռեակցիայի խառնուրդ (cDNA ջերմային մեկնարկի սինթեզ):Այս մոտեցումն օգնում է կանխել միջմոլեկուլային հիմքերի զուգավորումը, որը տեղի է ունենում ավելի ցածր ջերմաստիճաններում:PCR գործիքի օգտագործումը պարզեցնում է RT-PCR-ի համար անհրաժեշտ բազմաթիվ ջերմաստիճանի անջատիչներ:

Tth ջերմային կայունացված պոլիմերազը գործում է որպես ԴՆԹ պոլիմերազ Mg2+ և ՌՆԹ պոլիմերազի առկայության դեպքում Mn2+-ի առկայության դեպքում:Այն կարող է պահել ջերմությունը մինչև 65℃:Այնուամենայնիվ, PCR-ի ժամանակ Mn2+-ի առկայությունը նվազեցնում է հավատարմությունը, ինչը Tth պոլիմերազին դարձնում է ավելի քիչ հարմար բարձր ճշգրտության ուժեղացման համար, ինչպիսին է cDNA-ի կլոնավորումը:Բացի այդ, Tth-ն ավելի քիչ արդյունավետ է հակադարձ տրանսկրիպցիայի ժամանակ, ինչը նվազեցնում է զգայունությունը, և քանի որ մեկ ֆերմենտը կարող է կատարել հակադարձ տրանսկրիպցիա և PCR, առանց հակադարձ տրանսկրիպցիայի հսկիչ ռեակցիաները չեն կարող օգտագործվել cDNA-ի ուժեղացված արտադրանքները գենոմային աղտոտված ԴՆԹ-ից տարբերելու համար:

4. Հավելում, որը նպաստում է հակադարձ տառադարձմանը.

Հավելումների, ներառյալ գլիցերինի և DMSO-ի ավելացումը շղթայական սինթեզի առաջին ռեակցիային կարող է նվազեցնել նուկլեինաթթվի կրկնակի շղթայի կայունությունը և արձակել ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը:Կարող է ավելացվել մինչև 20% գլիցերին կամ 10% DMSO՝ առանց SuperScriptⅡ-ի կամ MMLV-ի գործունեության վրա ազդելու:AMV-ն կարող է նաև հանդուրժել մինչև 20% գլիցերին՝ չնվազեցնելով ակտիվությունը:SuperScriptⅡ հակադարձ արտագրման ռեակցիայում RT-PCR-ի զգայունությունը առավելագույնի հասցնելու համար 10% գլիցերին կարող է ավելացվել և մեկուսացվել 45℃ ջերմաստիճանում:Եթե ​​PCR-ին ավելացվում է ռետրոտրանսկրիպցիոն ռեակցիայի արտադրանքի 1/10-ը, ապա ուժեղացման ռեակցիայում գլիցերինի կոնցենտրացիան կազմում է 0,4%, ինչը բավարար չէ PCR-ն արգելակելու համար:

5. RNaseH մշակում:

Զգայունությունը կարող է բարելավվել՝ բուժելով cDNA սինթեզի ռեակցիաները RNaseH-ով մինչև PCR-ն:Որոշ ձևանմուշների համար ենթադրվում է, որ cDNA-ի սինթեզի ռեակցիայի ՌՆԹ-ն կանխում է ուժեղացված արտադրանքների միացումը, որի դեպքում RNaseH բուժումը կարող է մեծացնել զգայունությունը:Ընդհանրապես, RNaseH բուժումը պահանջվում է համեմատաբար երկար, ամբողջական երկարությամբ cDNA թիրախային ձևանմուշի ուժեղացման համար, ինչպիսին է տուբերային սքերոզըⅡ ցածր պատճենով:Այս դժվար ձևանմուշի համար RNaseH-ն ուժեղացրել է SuperScriptⅡ-ի կամ AMV-ի կողմից սինթեզված cDNA-ի կողմից գեներացված ազդանշանը:RT-PCR ռեակցիաների մեծ մասի համար RNaseH բուժումը կամընտիր է, քանի որ 95℃ մեկուսացված PCR-ի դենատուրացիայի քայլը սովորաբար հիդրոլիզացնում է ՌՆԹ-ն ՌՆԹ-ից՝ ԴՆԹ համալիրից:

6. ՌՆԹ-ի փոքր քանակությունների հայտնաբերման բարելավված մեթոդներ.

RT-PCR-ն հատկապես դժվար է, երբ հասանելի են միայն փոքր քանակությամբ ՌՆԹ:Գլիկոգենի ավելացումը որպես կրիչ ՌՆԹ-ի տարանջատման ժամանակ օգնում է մեծացնել փոքր նմուշների բերքատվությունը։Trizol-ի հետ միաժամանակ կարող է ավելացվել RNase առանց գլիկոգեն:Գլիկոգենը ջրում լուծվող է և կարող է մնալ ջրային փուլում ՌՆԹ-ի հետ՝ օգնելու հետագա տեղումներին:ՌՆազազերծ գլիկոգենի առաջարկվող կոնցենտրացիան 250 մկգ/մլ է 50 մգ-ից պակաս հյուսվածքի կամ 106 մշակված բջիջների նմուշների համար:

SuperScriptⅡ-ի միջոցով հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիաներին ացետիլացված BSA-ի ավելացումը կարող է մեծացնել զգայունությունը, իսկ փոքր քանակությամբ ՌՆԹ-ի դեպքում՝ նվազեցնելով SuperScriptⅡ-ի քանակը և ավելացնելով 40 միավոր RnaseOut նուկլեազի ինհիբիտորը, կարող է բարելավել հայտնաբերման մակարդակը:Եթե ​​գլիկոգենն օգտագործվում է ՌՆԹ-ի տարանջատման համար, ապա դեռ խորհուրդ է տրվում ավելացնել BSA կամ RNase ինհիբիտորներ՝ հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիաները՝ օգտագործելով SuperScriptⅡ:

Ⅱ. Բարձրացնել RT-PCR-ի առանձնահատկությունը

1. cNDA սինթեզ.

Առաջին շղթայի cDNA սինթեզը սկսելու համար կարող են օգտագործվել երեք տարբեր մեթոդներ, և յուրաքանչյուր մեթոդի հարաբերական առանձնահատկությունն ազդում է սինթեզված cDNA-ի քանակի և տեսակի վրա:

Պատահական այբբենարանի մեթոդը երեք մեթոդներից ամենաքիչն է:Այբբենարանները զտվում են բազմաթիվ տեղամասերում ամբողջ տառադարձության ընթացքում՝ կարճ, մասնակի երկարությամբ cDNA արտադրելու համար:Այս մեթոդը հաճախ օգտագործվում է 5' տերմինալային հաջորդականություններ և cDNA ստանալու համար ՌՆԹ ձևանմուշներից՝ երկրորդական կառուցվածքային շրջաններով կամ վերջացող վայրերով, որոնք հակադարձ տրանսկրիպտազը չի կարող վերարտադրվել:Ամենաերկար cDNA-ն ստանալու համար ՌՆԹ-ի յուրաքանչյուր նմուշում պրայմերների և ՌՆԹ-ի հարաբերակցությունը պետք է էմպիրիկորեն որոշվի:Պատահական պրայմերների սկզբնական կոնցենտրացիան տատանվում է 50-ից մինչև 250 նգ 20 մկլ ռեակցիայի համակարգում:Քանի որ պատահական պրայմերների օգտագործմամբ ընդհանուր ՌՆԹ-ից սինթեզված cDNA-ն հիմնականում ռիբոսոմային ՌՆԹ է, որպես ձևանմուշ սովորաբար ընտրվում է պոլի(Ա)+ՌՆԹ:

Oligo(dT) մեկնարկը ավելի կոնկրետ է, քան պատահական պրայմերները:Այն հիբրիդացվում է էուկարիոտիկ բջիջների մեծ մասում հայտնաբերված mRNA-ի 3' վերջում գտնվող պոլի(A) պոչի հետ:Քանի որ պոլի(Ա)+ՌՆԹ-ն ընդհանուր ՌՆԹ-ի մոտավորապես 1%-ից 2%-ն է, cDNA-ի քանակն ու բարդությունը շատ ավելի քիչ է, քան պատահական պրայմերների օգտագործման դեպքում:Իր բարձր յուրահատկության պատճառով օլիգո(dT) սովորաբար չի պահանջում օպտիմալացում ՌՆԹ-ի այբբենարանի հարաբերակցության և պոլի(A)+ ընտրության համար:Խորհուրդ է տրվում օգտագործել 0,5 մկգ օլիգո(dT) 20 մկլ ռեակցիայի համակարգում:oligo(dT)12-18-ը հարմար է RT-PCR-ի մեծ մասի համար:ThermoScript RT-PCR համակարգը ապահովում է օլիգո(dT)20՝ իր լավ ջերմային կայունության պատճառով և հարմար է պահպանման ավելի բարձր ջերմաստիճանների համար:

Գեն-սպեցիֆիկ պրայմերները (GSP) հակադարձ տրանսկրիպցիայի փուլի լավագույն հատուկ պրայմերներն են:GSP-ն հակասիտային օլիգոնուկլեոզիդ է, որը կարող է հատուկ հիբրիդացվել ՌՆԹ-ի նպատակային հաջորդականությունների հետ, այլ ոչ թե կցել բոլոր Rnas-երը, ինչպես պատահական պրայմերները կամ օլիգո(dT):PCR պրայմերների նախագծման համար օգտագործվող կանոնները կիրառվում են նաև հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիայի GSP-ի նախագծման համար:GSP-ն կարող է լինել նույն հաջորդականությունը, ինչ ամպլիֆիկացման այբբենարանը, որը կռվում է mRNA3'-ի վերջում, կամ GSP-ն կարող է նախագծվել հակադարձ ուժեղացման այբբենարանով հոսանքից ներքև զտվելու համար:Որոշ ուժեղացված օբյեկտների համար անհրաժեշտ է նախագծել մեկից ավելի հակազգայուն այբբենարան հաջող RT-PCR-ի համար, քանի որ թիրախ ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը կարող է կանխել այբբենարանի միացումը:Առաջարկվում է օգտագործել 1pmol հակազգայական GSP առաջին շղթայական սինթեզի ռեակցիայի համակարգում՝ 20 μl:

2. Բարձրացնել հակադարձ արտագրման ջերմության պահպանման ջերմաստիճանը.

GSP-ի առանձնահատկությունից լիարժեք օգտվելու համար պետք է օգտագործվի բարձր ջերմային կայունությամբ հակադարձ տրանսկրիպտազը:Ջերմակայուն հակադարձ տրանսկրիպտազը կարող է մեկուսացվել ավելի բարձր ջերմաստիճաններում՝ բարձրացնելու ռեակցիայի խստությունը:Օրինակ, եթե GSP-ը զտվում է 55°C-ում, ապա GSP-ի առանձնահատկությունն ամբողջությամբ չի օգտագործվում, եթե հակադարձ տառադարձումն իրականացվում է 37°C ջերմաստիճանում ցածր խստությամբ՝ օգտագործելով AMV կամ M-MLV:Այնուամենայնիվ, SuperScripⅡ-ը և ThermoScript-ը կարող են արձագանքել 50℃ կամ ավելի բարձր ջերմաստիճանում, ինչը վերացնում է ավելի ցածր ջերմաստիճանում արտադրված ոչ հատուկ արտադրանքները:Առավելագույն յուրահատկության համար ՌՆԹ/ այբբենարան խառնուրդը կարող է ուղղակիորեն տեղափոխվել 65℃ դենատուրացիայի ջերմաստիճանից դեպի հակադարձ տառադարձման պահպանման ջերմաստիճան՝ նախապես տաքացված 2 x ռեակցիայի խառնուրդի ավելացմամբ (cDNA սինթեզի ջերմային մեկնարկ):Սա օգնում է կանխել հիմքերի զուգավորումը մոլեկուլների միջև ցածր ջերմաստիճանում:PCR գործիքի օգտագործումը պարզեցնում է RT-PCR-ի համար պահանջվող բազմաթիվ ջերմաստիճանի անցումները:

3. Նվազեցնել գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը.

RT-PCR-ի հետ կապված հնարավոր դժվարություններից մեկն այն է, որ ՌՆԹ-ն աղտոտում է գենոմային ԴՆԹ-ն:ՌՆԹ-ի ավելի լավ տարանջատման մեթոդների օգտագործումը, ինչպիսին է Տրիզոլ ռեագենտը, նվազեցնում է գենոմային ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը ՌՆԹ պատրաստուկներում:Գենոմային ԴՆԹ-ից արտադրված արտադրանքներից խուսափելու համար ՌՆԹ-ն կարող է մշակվել ուժեղացման աստիճանի DnasⅠ-ով, որպեսզի հեռացվի աղտոտված ԴՆԹ-ն՝ նախքան հակադարձ տրանսկրիպցիան:Նմուշները պահվել են 65℃ ջերմաստիճանում 2.0mM EDTA-ում 10 րոպե՝ DNaseⅠ մարսողությունը դադարեցնելու համար:EDTA-ն քելացնում է մագնեզիումի իոնները՝ կանխելու մագնեզիումի իոնային կախված ՌՆԹ հիդրոլիզը, որը տեղի է ունենում բարձր ջերմաստիճաններում:

Ամրապնդված cDNA-ն գենոմի ԴՆԹ-ի ուժեղացման արտադրանքից առանձնացնելու համար կարող են նախագծվել այբբենարաններ, որոնք առանձին զտվում են առանձնացված էկզոնի հետ:cDNA-ից ստացված PCR արտադրանքներն ավելի կարճ կլինեն, քան աղտոտված գենոմային ԴՆԹ-ից ստացվածները:Վերահսկվող փորձ՝ առանց հակադարձ տառադարձման, կատարվում է նաև ՌՆԹ-ի յուրաքանչյուր ձևանմուշի վրա՝ որոշելու համար՝ արդյոք տվյալ հատվածը գենոմային ԴՆԹ-ից է կամ cDNA-ից:Հակադարձ տրանսկրիպցիայի բացակայության դեպքում ստացված PCR արտադրանքները ստացվում են գենոմից:

Հարակից արտադրանք

RT-PCR Հեշտ^ᵀᴹԵս (Մեկ քայլ)

-Մեկ քայլանոց հավաքածուն հնարավորություն է տալիս հակադարձ տառադարձումը և ՊՇՌ-ն իրականացնել նույն խողովակում:Այն պետք է միայն ավելացնել կաղապարային ՌՆԹ, հատուկ PCR պրայմերներ և RNase-Free ddH₂O.

-ՌՆԹ-ի քանակական վերլուծությունը իրական ժամանակում կարող է իրականացվել արագ և ճշգրիտ:

-Հավաքածուն օգտագործում է եզակի Foregene հակադարձ տրանսկրիպցիայի ռեագենտ և Foregene HotStar Taq ԴՆԹ պոլիմերազ՝ զուգակցված յուրահատուկ ռեակցիայի համակարգի հետ՝ արդյունավետորեն բարելավելու ռեակցիայի ուժեղացման արդյունավետությունն ու առանձնահատկությունը:

- Օպտիմիզացված ռեակցիայի համակարգը ստիպում է ռեակցիան ունենալ ավելի բարձր հայտնաբերման զգայունություն, ավելի ուժեղ ջերմային կայունություն և ավելի լավ հանդուրժողականություն:

RT Easy II (GDNase-ով) Master Premix առաջին շղթայի CDNA սինթեզի համար իրական ժամանակում PCR GDNase-ով

-ԳԴՆԹ-ի հեռացման արդյունավետ ունակություն, որը կարող է հեռացնել gDNA-ն կաղապարում 2 րոպեի ընթացքում:

- Արդյունավետ հակադարձ արտագրման համակարգ, առաջին շղթայի cDNA-ի սինթեզն ավարտելու համար պահանջվում է ընդամենը 15 րոպե:

-Բարդ ձևանմուշներ. GC-ի բարձր պարունակությամբ և բարդ երկրորդական կառուցվածքով կաղապարները կարող են նաև հետափոխվել բարձր արդյունավետությամբ:

-Բարձր զգայունության հակադարձ արտագրման համակարգ, pg մակարդակի կաղապարները կարող են նաև ստանալ բարձրորակ cDNA:

-Հակադարձ արտագրման համակարգն ունի բարձր ջերմային կայունություն, ռեակցիայի օպտիմալ ջերմաստիճանը 42℃ է, և այն դեռևս ունի լավ հակադարձ տառադարձման կատարում 50℃-ում: