1. Հիմնական գիտելիքներ (եթե ցանկանում եք տեսնել փորձարարական մասը, խնդրում ենք անմիջապես փոխանցել երկրորդ մաս)
Որպես սովորական PCR-ի ածանցյալ ռեակցիա, իրական ժամանակում PCR-ը հիմնականում վերահսկում է ուժեղացման արտադրանքի քանակի փոփոխությունը PCR ուժեղացման ռեակցիայի յուրաքանչյուր ցիկլում իրական ժամանակում՝ ֆլյուորեսցենտային ազդանշանի փոփոխության միջոցով և քանակապես վերլուծում է մեկնարկային ձևանմուշը՝ ct արժեքի և ստանդարտ կորի փոխհարաբերությունների միջոցով:
RT-PCR-ի կոնկրետ տվյալներն ենբազային, լյումինեսցենտային շեմըևCt արժեքը.
ելակետ: | 3-15-րդ ցիկլի ֆլուորեսցենտային արժեքը բազային է (բազային), որն առաջանում է չափումների երբեմն սխալմամբ: |
Շեմ (շեմ): | Վերաբերում է ֆլյուորեսցենցիայի հայտնաբերման սահմանին, որը սահմանված է ուժեղացման կորի էքսպոնենցիալ աճի գոտում համապատասխան դիրքում, որը սովորաբար 10 անգամ գերազանցում է բազային գծի ստանդարտ շեղումը: |
CT արժեքը: | Այն PCR ցիկլերի քանակն է, երբ յուրաքանչյուր ռեակցիայի խողովակում ֆլուորեսցենտային արժեքը հասնում է շեմին: Ct արժեքը հակադարձ համեմատական է սկզբնական կաղապարի քանակին: |
RT-PCR-ի պիտակավորման ընդհանուր մեթոդներ.
մեթոդ | առավելություն | թերություն | կիրառման շրջանակը |
SYBR GreenⅠ | Լայն կիրառելիություն, զգայուն, էժան և հարմար | Այբբենարանի պահանջները բարձր են, հակված են ոչ հատուկ ժապավենների | Այն հարմար է տարբեր թիրախային գեների քանակական վերլուծության, գեների արտահայտման և տրանսգենային ռեկոմբինանտ կենդանիների և բույսերի հետազոտությունների համար: |
TaqMan | Լավ կոնկրետություն և բարձր կրկնելիություն | Գինը բարձր է և հարմար է միայն կոնկրետ նպատակների համար: | Պաթոգենների հայտնաբերում, դեղերի դիմադրության գեների հետազոտություն, դեղամիջոցների արդյունավետության գնահատում, գենետիկ հիվանդությունների ախտորոշում: |
մոլեկուլային փարոս | Բարձր կոնկրետություն, լյումինեսցենտություն, ցածր ֆոն | Գինը բարձր է, հարմար է միայն կոնկրետ նպատակի համար, դիզայնը բարդ է, իսկ գինը՝ բարձր։ | Հատուկ գեների վերլուծություն, SNP վերլուծություն |
2. Փորձարարական քայլեր
2.1 Փորձարարական խմբավորման մասին- խմբում պետք է լինեն բազմաթիվ հորեր, և պետք է լինեն կենսաբանական կրկնություններ:
① | Դատարկ հսկողություն | Օգտագործվում է փորձերում բջիջների աճի կարգավիճակը հայտնաբերելու համար |
② | Բացասական վերահսկողության siRNA (ոչ հատուկ siRNA հաջորդականություն) | Ցույց տալ RNAi-ի գործողության առանձնահատկությունը:siRNA-ն կարող է առաջացնել ոչ սպեցիֆիկ սթրեսային արձագանք 200nM կոնցենտրացիայի դեպքում: |
③ | Տրանսֆեկցիոն ռեագենտի վերահսկում | Բացառել տրանսֆեկցիոն ռեագենտի թունավորությունը բջիջներին կամ ազդեցությունը թիրախային գենի արտահայտման վրա |
④ | siRNA թիրախային գենի դեմ | Թուլացրեք թիրախային գենի արտահայտությունը |
⑤ (ըստ ցանկության) | դրական siRNA | Օգտագործվում է փորձարարական համակարգի և գործառնական խնդիրների լուծման համար |
⑥ (ըստ ցանկության) | Լյումինեսցենտային հսկիչ siRNA | Բջջի փոխակերպման արդյունավետությունը կարելի է դիտարկել մանրադիտակով |
2.2 Այբբենարանի ձևավորման սկզբունքները
Ընդլայնված հատվածի չափը | Ցանկալի է 100-150bp |
Այբբենարանի երկարությունը | 18-25 bp |
GC բովանդակությունը | 30%-70%, ցանկալի է 45%-55% |
Tm արժեքը | 58-60℃ |
Հերթականություն | Խուսափեք T/C շարունակական;A/G շարունակական |
3 վերջի հաջորդականությունը | Խուսափեք GC հարուստ կամ AT հարուստ;տերմինալային հիմքը նախընտրելի է G կամ C;ավելի լավ է խուսափել Տ |
Կոմպլեմենտարություն | Խուսափեք 3-ից ավելի հիմքերի լրացուցիչ հաջորդականություններից այբբենարանի ներսում կամ երկու այբբենարանների միջև |
Կոնկրետություն | Օգտագործեք պայթյունի որոնում՝ այբբենարանի առանձնահատկությունը հաստատելու համար |
①SiRNA-ն տեսակների հատուկ է, և տարբեր տեսակների հաջորդականությունները տարբեր կլինեն:
②SiRNA-ն փաթեթավորված է սառեցված չորացրած փոշու մեջ, որը կարելի է կայուն պահել 2-4 շաբաթ սենյակային ջերմաստիճանում:
2.3 Գործիքներ կամ ռեակտիվներ, որոնք պետք է նախապես պատրաստվեն
Primer (ներքին հղում) | Ներառյալ երկու առաջ և հետընթաց |
Պրայմերներ (թիրախային գեն) | Ներառյալ երկու առաջ և հետընթաց |
Թիրախ Si RNA (3 շերտ) | Ընդհանուր առմամբ, ընկերությունը սինթեզում է 3 ժապավեն, այնուհետև ընտրում է երեքից մեկը RT-PCR-ով: |
Տրանսֆեկցիոն հավաքածու | Lipo2000 և այլն: |
ՌՆԹ արագ արդյունահանման հավաքածու | Տրանսֆեկցիայից հետո ՌՆԹ արդյունահանման համար |
Արագ հակադարձ տառադարձման հավաքածու | cDNA սինթեզի համար |
PCR ուժեղացման հավաքածու | 2×Super SYBR Կանաչ qPCR Master Mix |
2.4 Ինչ վերաբերում է այն խնդիրներին, որոնց վրա պետք է ուշադրություն դարձնել կոնկրետ փորձարարական քայլերում.
①siRNA տրանսֆեկցիոն գործընթաց
1. Ծաղկապատման համար կարող եք ընտրել 24 հորատանցքի ափսե, 12 հորատանցք կամ 6 հորատանցք (24 հորատանցքի յուրաքանչյուր հորում առաջարկվող ՌՆԹ-ի միջին կոնցենտրացիան մոտ 100-300 նգ/ուլտր է), իսկ բջիջների փոխակերպման օպտիմալ խտությունը մինչև 60%-80% է կամ ավելին:
2. Տրանսֆեկցիոն քայլերը և հատուկ պահանջները խստորեն համապատասխանում են հրահանգներին:
3. Տրանսֆեկցիայից հետո նմուշները կարող են հավաքվել 24-72 ժամվա ընթացքում mRNA հայտնաբերման (RT-PCR) կամ սպիտակուցի հայտնաբերման համար 48-96 ժամվա ընթացքում (WB)
② ՌՆԹ արդյունահանման գործընթաց
1. Կանխել էկզոգեն ֆերմենտներով աղտոտումը:Այն հիմնականում ներառում է խստորեն դիմակներ և ձեռնոցներ կրելը.օգտագործելով ստերիլիզացված պիպետտի ծայրեր և EP խողովակներ;Փորձի ժամանակ օգտագործվող ջուրը պետք է լինի առանց RNase-ի:
2. Խորհուրդ է տրվում անել երկու անգամ, ինչպես առաջարկվում է արագ արդյունահանման հավաքածուում, որն իսկապես կբարելավի մաքրությունը և բերքատվությունը:
3. Թափոնային հեղուկը չպետք է դիպչի ՌՆԹ սյունին:
③ ՌՆԹ քանակականացում
ՌՆԹ-ն արդյունահանվելուց հետո այն կարելի է քանակականացնել ուղղակիորեն Nanodrop-ի միջոցով, և նվազագույն ցուցանիշը կարող է լինել մինչև 10նգ/ուլ:
④Հակադարձ արտագրման գործընթաց
1. Շնորհիվ RT-qPCR-ի բարձր զգայունության, յուրաքանչյուր նմուշի համար պետք է կատարվեն առնվազն 3 զուգահեռ հորեր, որպեսզի կանխվի հետագա Ct-ի չափազանց տարբեր լինելը կամ SD-ի չափից մեծ լինելը վիճակագրական վերլուծության համար:
2. Մի սառեցրեք և մի քանի անգամ հալեցրեք Master mix-ը:
3. Յուրաքանչյուր խողովակ/անցք պետք է փոխարինվի նոր ծայրով:Շարունակաբար մի օգտագործեք նույն պիպետտի ծայրը նմուշներ ավելացնելու համար:
4. Նմուշը ավելացնելուց հետո 96 հորատանցքի ափսեին ամրացված թաղանթը պետք է հարթել ափսեով:Ավելի լավ է ցենտրիֆուգ անել նախքան այն մեքենայի վրա դնելը, որպեսզի խողովակի պատի հեղուկը կարողանա հոսել ներքև և հեռացնել օդային փուչիկները:
⑤Ընդհանուր կորի վերլուծություն
Լոգարիթմական աճի ժամանակաշրջան չկա | Հնարավոր է, որ կաղապարի բարձր կոնցենտրացիան |
CT արժեք չկա | Լյումինեսցենտային ազդանշանների հայտնաբերման սխալ քայլեր; պրայմերների կամ զոնդերի դեգրադացիա – դրա ամբողջականությունը կարելի է հայտնաբերել PAGE էլեկտրոֆորեզի միջոցով; կաղապարի անբավարար քանակություն; կաղապարների դեգրադացիան – խուսափել կեղտերի ներմուծումից և կրկնակի սառեցումից ու հալեցումից նմուշների պատրաստման մեջ. |
Ct>38 | Ուժեղացման ցածր արդյունավետություն;PCR արտադրանքը չափազանց երկար է;տարբեր ռեակցիաների բաղադրիչները քայքայվում են |
Գծային ուժեղացման կոր | Զոնդերը կարող են մասամբ քայքայվել սառեցման-հալման կրկնվող ցիկլերի կամ լույսի երկարատև ազդեցության պատճառով |
Կրկնվող անցքերի տարբերությունը հատկապես մեծ է | Ռեակցիայի լուծույթը ամբողջությամբ չի հալված կամ ռեակցիայի լուծույթը չի խառնվում.PCR գործիքի ջերմային բաղնիքը աղտոտված է լյումինեսցենտ նյութերով |
2.5 Տվյալների վերլուծության մասին
qPCR-ի տվյալների վերլուծությունը կարելի է բաժանել հարաբերական քանակականացման և բացարձակ քանակականացման:Օրինակ՝ բուժման խմբի բջիջները համեմատած հսկիչ խմբի բջիջների հետ,
Քանի անգամ է փոխվում X գենի mRNA-ն, սա հարաբերական քանակականացում է.որոշակի քանակությամբ բջիջներում՝ X գենի mRNA-ն
Քանի օրինակ կա, սա բացարձակ քանակություն է։Սովորաբար այն, ինչ մենք ամենաշատն օգտագործում ենք լաբորատորիայում, հարաբերական քանակական մեթոդն է:Սովորաբար,2-ΔΔct մեթոդըԱմենաշատն օգտագործվում է փորձերում, ուստի այստեղ մանրամասն կներկայացվի միայն այս մեթոդը:
2-ΔΔct մեթոդ. Ստացված արդյունքը փորձարարական խմբում թիրախ գենի արտահայտման տարբերությունն է վերահսկիչ խմբի թիրախ գենի նկատմամբ:Պահանջվում է, որ ինչպես թիրախ գենի, այնպես էլ ներքին հղումային գենի ուժեղացման արդյունավետությունը մոտ լինի 100%-ին, իսկ հարաբերական շեղումը չպետք է գերազանցի 5%-ը։
Հաշվարկի մեթոդը հետևյալն է.
Δct վերահսկիչ խումբ = թիրախային գենի ct արժեքը վերահսկիչ խմբում – ct արժեքը ներքին հղումային գենի վերահսկիչ խմբում
Δct փորձարարական խումբ = փորձարարական խմբում թիրախային գենի ct արժեքը – փորձարարական խմբում ներքին հղումային գենի ct արժեքը
ΔΔct=Δct փորձարարական խումբ-Δct հսկիչ խումբ
Վերջապես, հաշվարկեք արտահայտության մակարդակի տարբերության բազմապատիկը.
Փոխել Fold=2-ΔΔct (excel ֆունկցիային համապատասխանում է POWER)
Առնչվող ապրանքներ.
Տեղադրման ժամանակը` մայիս-20-2023