1. Հիմնական գիտելիքներ (եթե ցանկանում եք տեսնել փորձարարական մասը, խնդրում ենք անմիջապես փոխանցել երկրորդ մաս)

Որպես սովորական PCR-ի ածանցյալ ռեակցիա, իրական ժամանակում PCR-ը հիմնականում վերահսկում է ուժեղացման արտադրանքի քանակի փոփոխությունը PCR ուժեղացման ռեակցիայի յուրաքանչյուր ցիկլում իրական ժամանակում՝ ֆլյուորեսցենտային ազդանշանի փոփոխության միջոցով և քանակապես վերլուծում է մեկնարկային ձևանմուշը՝ ct արժեքի և ստանդարտ կորի փոխհարաբերությունների միջոցով:

RT-PCR-ի կոնկրետ տվյալներն ենբազային, լյումինեսցենտային շեմըևCt արժեքը.

RT-PCR-ի պիտակավորման ընդհանուր մեթոդներ.

2. Փորձարարական քայլեր

2.1 Փորձարարական խմբավորման մասին- խմբում պետք է լինեն բազմաթիվ հորեր, և պետք է լինեն կենսաբանական կրկնություններ:

2.2 Այբբենարանի ձևավորման սկզբունքները

①SiRNA-ն տեսակների հատուկ է, և տարբեր տեսակների հաջորդականությունները տարբեր կլինեն:

②SiRNA-ն փաթեթավորված է սառեցված չորացրած փոշու մեջ, որը կարելի է կայուն պահել 2-4 շաբաթ սենյակային ջերմաստիճանում:

2.3 Գործիքներ կամ ռեակտիվներ, որոնք պետք է նախապես պատրաստվեն

2.4 Ինչ վերաբերում է այն խնդիրներին, որոնց վրա պետք է ուշադրություն դարձնել կոնկրետ փորձարարական քայլերում.

①siRNA տրանսֆեկցիոն գործընթաց

1. Ծաղկապատման համար կարող եք ընտրել 24 հորատանցքի ափսե, 12 հորատանցք կամ 6 հորատանցք (24 հորատանցքի յուրաքանչյուր հորում առաջարկվող ՌՆԹ-ի միջին կոնցենտրացիան մոտ 100-300 նգ/ուլտր է), իսկ բջիջների փոխակերպման օպտիմալ խտությունը մինչև 60%-80% է կամ ավելին:

2. Տրանսֆեկցիոն քայլերը և հատուկ պահանջները խստորեն համապատասխանում են հրահանգներին:

3. Տրանսֆեկցիայից հետո նմուշները կարող են հավաքվել 24-72 ժամվա ընթացքում mRNA հայտնաբերման (RT-PCR) կամ սպիտակուցի հայտնաբերման համար 48-96 ժամվա ընթացքում (WB)

② ՌՆԹ արդյունահանման գործընթաց

1. Կանխել էկզոգեն ֆերմենտներով աղտոտումը:Այն հիմնականում ներառում է խստորեն դիմակներ և ձեռնոցներ կրելը.օգտագործելով ստերիլիզացված պիպետտի ծայրեր և EP խողովակներ;Փորձի ժամանակ օգտագործվող ջուրը պետք է լինի առանց RNase-ի:

2. Խորհուրդ է տրվում անել երկու անգամ, ինչպես առաջարկվում է արագ արդյունահանման հավաքածուում, որն իսկապես կբարելավի մաքրությունը և բերքատվությունը:

3. Թափոնային հեղուկը չպետք է դիպչի ՌՆԹ սյունին:

③ ՌՆԹ քանակականացում

ՌՆԹ-ն արդյունահանվելուց հետո այն կարելի է քանակականացնել ուղղակիորեն Nanodrop-ի միջոցով, և նվազագույն ցուցանիշը կարող է լինել մինչև 10նգ/ուլ:

④Հակադարձ արտագրման գործընթաց

1. Շնորհիվ RT-qPCR-ի բարձր զգայունության, յուրաքանչյուր նմուշի համար պետք է կատարվեն առնվազն 3 զուգահեռ հորեր, որպեսզի կանխվի հետագա Ct-ի չափազանց տարբեր լինելը կամ SD-ի չափից մեծ լինելը վիճակագրական վերլուծության համար:

2. Մի սառեցրեք և մի քանի անգամ հալեցրեք Master mix-ը:

3. Յուրաքանչյուր խողովակ/անցք պետք է փոխարինվի նոր ծայրով:Շարունակաբար մի օգտագործեք նույն պիպետտի ծայրը նմուշներ ավելացնելու համար:

4. Նմուշը ավելացնելուց հետո 96 հորատանցքի ափսեին ամրացված թաղանթը պետք է հարթել ափսեով:Ավելի լավ է ցենտրիֆուգ անել նախքան այն մեքենայի վրա դնելը, որպեսզի խողովակի պատի հեղուկը կարողանա հոսել ներքև և հեռացնել օդային փուչիկները:

⑤Ընդհանուր կորի վերլուծություն

2.5 Տվյալների վերլուծության մասին

qPCR-ի տվյալների վերլուծությունը կարելի է բաժանել հարաբերական քանակականացման և բացարձակ քանակականացման:Օրինակ՝ բուժման խմբի բջիջները համեմատած հսկիչ խմբի բջիջների հետ,

Քանի անգամ է փոխվում X գենի mRNA-ն, սա հարաբերական քանակականացում է.որոշակի քանակությամբ բջիջներում՝ X գենի mRNA-ն

Քանի օրինակ կա, սա բացարձակ քանակություն է։Սովորաբար այն, ինչ մենք ամենաշատն օգտագործում ենք լաբորատորիայում, հարաբերական քանակական մեթոդն է:Սովորաբար,2-ΔΔct մեթոդըԱմենաշատն օգտագործվում է փորձերում, ուստի այստեղ մանրամասն կներկայացվի միայն այս մեթոդը:

2-ΔΔct մեթոդ. Ստացված արդյունքը փորձարարական խմբում թիրախ գենի արտահայտման տարբերությունն է վերահսկիչ խմբի թիրախ գենի նկատմամբ:Պահանջվում է, որ ինչպես թիրախ գենի, այնպես էլ ներքին հղումային գենի ուժեղացման արդյունավետությունը մոտ լինի 100%-ին, իսկ հարաբերական շեղումը չպետք է գերազանցի 5%-ը։

Հաշվարկի մեթոդը հետևյալն է.

Δct վերահսկիչ խումբ = թիրախային գենի ct արժեքը վերահսկիչ խմբում – ct արժեքը ներքին հղումային գենի վերահսկիչ խմբում

Δct փորձարարական խումբ = փորձարարական խմբում թիրախային գենի ct արժեքը – փորձարարական խմբում ներքին հղումային գենի ct արժեքը

ΔΔct=Δct փորձարարական խումբ-Δct հսկիչ խումբ

Վերջապես, հաշվարկեք արտահայտության մակարդակի տարբերության բազմապատիկը.

Փոխել Fold=2-ΔΔct (excel ֆունկցիային համապատասխանում է POWER)

Առնչվող ապրանքներ.

Cell Direct RT-qPCR հավաքածու