Վերջերս ես զարմանալի բան հայտնաբերեցի:Շատ առաջադեմ փորձարարներ նրա շրջապատում նույնիսկ չգիտեն մի քանի շատ տարրական փորձարարական գիտելիքներ:

Օրինակ՝ կարո՞ղ եք պատասխանել հետևյալ հարցերին.

Կա՞ տարբերություն OD260-ի և A260-ի միջև:Ի՞նչ է նշանակում յուրաքանչյուրը:
OD-ը օպտիկական խտության հապավումն է (օպտիկական խտություն), A-ն կլանման (կլանման) հապավումն է, երկու հասկացությունները իրականում նույնն են, «օպտիկական խտությունը» «կլանում» է, բայց «օպտիկական խտությունը» համահունչ է ազգային ստանդարտների մեծամասնությանը և ավելի ստանդարտացված:

Սովորաբար մենք չափում ենք OD-ի արժեքը 260 նմ-ում՝ նուկլեինաթթվի կոնցենտրացիան հաշվարկելու համար, ուստի ի՞նչ է ներկայացնում 1OD-ը:
Նուկլեինաթթուն ունի կլանման առավելագույն գագաթնակետ 260 նմ ալիքի երկարությամբ, որը պարունակում է և՛ ԴՆԹ, և՛ ՌՆԹ, ինչպես նաև նուկլեինաթթվի մասնատված բեկորներ (սա հիմնական կետն է):
OD արժեքը, որը չափվել է 260 նմ ալիքի երկարության վրա, գրանցվել է որպես OD260:Եթե ​​նմուշը մաքուր է, OD260 արժեքը կարող է հաշվարկել նուկլեինաթթվի նմուշի կոնցենտրացիան:
1 OD260=50 մկգ/մլ dsDNA (երկաշղթա ԴՆԹ)
=37 մկգ/մլ ssDNA (միաշղթա ԴՆԹ)
=40 մկգ/մլ ՌՆԹ
=30 μg/ml dNTPs (օլիգոնուկլեոտիդներ)
Կա՞ որևէ կապ և տարբերություն RT-PCR-ի, Realtime-PCR-ի և QPCR-ի միջև:
RT-PCR-ն կրճատված է Reverse Transcription PCR-ի համար
Իրական ժամանակում PCR=qPCR, կրճատ՝ Quantitative Real Time PCR
Չնայած իրական ժամանակի PCR (իրական ժամանակի ֆլուորեսցենտային քանակական PCR) և Reverse Transcription PCR (հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR) երկուսն էլ կարծես կրճատված են որպես RT-PCR:Սակայն միջազգային կոնվենցիան հետևյալն է. RT-PCR-ն մասնավորապես վերաբերում է հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR-ին:

Որո՞նք են սովորաբար օգտագործվող nt-ը, bp-ը և kb-ը՝ կենսաբանության մեջ ԴՆԹ/ՌՆԹ-ի երկարությունը նկարագրելու համար:
nt = նուկլեոտիդ
bp = բազային զույգ բազային զույգ
kb = կիլոբազա

Իհարկե, դուք կասեք, որ շատերը թքած ունեն այս մանր մանրամասների վրա:Բոլորն են դա անում, և ոչ ոք ձեզ չի հարցնի, թե դա ինչ է:Գիտե՞ք, որ սա ավելորդ է, չէ՞:

Ոչ, ոչ, ոչ, դա շատ անհրաժեշտ է իմանալ:ինչի՞ պատճառով
Որովհետև ուզում եք հոդված տեղադրել:Եղբա՛յր։Անկախ նրանից, թե դուք նպատակ ունեք ավարտելու, թե գիտահետազոտական ​​նվաճումների հետամուտ, խոսելու համար պետք է ապավինեք հոդվածներին:

Նուկլեինաթթվի արդյունահանումը պետք է լինի ամենապարզ և հիմնական փորձը:Նուկլեինաթթվի արդյունահանման որակն ուղղակիորեն որոշում է հետագա փորձերի արդյունքները։

Չնայած ես դա բազմիցս ասել եմ, բայց դեռ շատ ընկերներ կան, որոնց դա չի հետաքրքրում։Այս անգամ ես որոշեցի դուրս գալ հոդվածից:

Նվազագույն տեղեկատվություն իրական ժամանակի քանակական PCR փորձերի հրապարակման համար, որը կոչվում է MIQE, ֆլուորեսցենտային քանակական փորձերի ուղեցույցների մի շարք է, որը գործարկվել է միջազգային մակարդակով, որն առաջարկում է նվազագույն չափորոշիչներ փորձարարական տեղեկատվության համար, որն անհրաժեշտ է ֆլյուորեսցենտային քանակական PCR փորձերի գնահատման և հոդվածներ հրապարակելու համար:Փորձարարի կողմից տրամադրված փորձարարական պայմանների և վերլուծության մեթոդների միջոցով գրախոսները կարող են ավելի լավ գնահատել հետազոտողի փորձարարական սխեմայի վավերականությունը:

Կարելի է տեսնել, որ նուկլեինաթթվի արդյունահանման բաժնում առաջարկվել են հայտնաբերման հետևյալ կետերը.

«E»-ն ցույց է տալիս տեղեկատվությունը, որը պետք է տրամադրվի, իսկ «D»-ն՝ անհրաժեշտության դեպքում:

Ձևը շատ բարդ է, իրականում ուզում եմ ասել, որ բոլորը պետք է սկսեն

մաքրությունը (D), եկամտաբերությունը (D), ամբողջականությունը (E) և հետևողականությունը (E) նուկլեինաթթուները գնահատելու համար այս չորս ասպեկտներում:

Ըստ փորձարարական սովորությունների, նախ խոսեք մաքրության և կենտրոնացման գնահատման մեթոդների մասին:

OD-ի չափումը փորձարարների համար ամենասիրված և ամենահեշտ հայտնաբերման մեթոդն է:Ինչ վերաբերում է սկզբունքին, ապա այստեղ չեմ մանրամասնի։Այժմ շատ լաբորատորիաներ օգտագործում են ուլտրա-միկրոսպեկտրոֆոտոմետրեր՝ ուղղակիորեն քանակապես վերլուծելու նուկլեինաթթվի նմուշները:Ներծծման արժեքը ցուցադրելիս ծրագիրը ուղղակիորեն տալիս է կոնցենտրացիայի արժեքը (նուկլեինաթթու, սպիտակուց և լյումինեսցենտ ներկ) և հարակից հարաբերակցությունները:Ինչ վերաբերում է OD արժեքի վերլուծությանը, ապա Պահպանեք այս նկարը և լավ կլինեք:

Ունիվերսալ OD արժեքի լուծման ցուցակ

Այնուամենայնիվ, կան մի քանի նախազգուշացումներ, որոնք պետք է առանձնացվեն ձեզ համար:

(Ի վերջո, ես գիտեմ, որ դուք պետք է լինեք նրանք, ովքեր խնայում են և սպասեք, մինչև ձեզ անհրաժեշտ լինեն:)

Ծանոթագրություն 1 Սարքավորումներ

OD արժեքի վրա կազդեն տարբեր սարքավորումներ:Քանի դեռ OD260-ը գտնվում է որոշակի տիրույթում, OD230 և OD280 արժեքները իմաստալից են:Օրինակ, սովորական Eppendorf D30-ի կլանման տիրույթը 260 նմ-ում 0-3 Ա է, իսկ NanoDrop One-ի Thermo-ն 260 նմ է:Ներծծման միջակայքը 0.5-62.5A:

Ծանոթագրություն 2Նոսրացման ռեագենտ

OD արժեքի վրա կարող է ազդել տարբեր ռեակտիվների նոսրացումը:Օրինակ, մաքրված ՌՆԹ-ի OD260/280 ընթերցումը pH-ում7,5 10 մմ Տրիսբուֆերը գտնվում է 1.9-2.1-ի միջև, մինչդեռ inչեզոք ջրային լուծույթհարաբերակցությունը կլինի ավելի ցածր, գուցե միայն 1.8-2.0, բայց դա չի նշանակում, որ ՌՆԹ-ի որակը փոխում է Տարբերությունը:

Ծանոթագրություն 3Մնացորդային նյութեր

Մնացորդային նյութերի առկայությունը կազդի նուկլեինաթթվի կոնցենտրացիայի չափման ճշգրտության վրա, ուստի անհրաժեշտ է հնարավորինս խուսափել նուկլեինաթթվի նմուշներում սպիտակուցի, ֆենոլի, պոլիսախարիդների և պոլիֆենոլի մնացորդներից:

Սակայն, ըստ էության, օրգանական ռեակտիվներով արդյունահանումը հին մեթոդ է։Առևտրային փաթեթներում արդյունահանման էֆեկտը կարելի է ձեռք բերել սիլիցիումի վրա հիմնված կլանման սյունակի միջոցով, որը զուգորդվում է ցենտրիֆուգմամբ՝ խուսափելով թունավոր և վնասակար օրգանական ռեակտիվներից, որոնք դժվար է հեռացվել և այլն:Foregene-ի նուկլեինաթթվի արդյունահանման հավաքածուն չի օգտագործում DNase/RNase և թունավոր օրգանական ռեակտիվներ ողջ գործողության ընթացքում, արագ և անվտանգ, եւազդեցությունն էլավ(պատահաբար ասաց, որ ճաղատ է, բայց գիտեմ, որ ուզում ես իմանալ):

Օրինակ 1. Գենոմային ԴՆԹ-ի արդյունահանման արդյունք և մաքրություն

Foregene հողի ԴՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածուն (DE-05511) մշակում է հողի նմուշները տարբեր աղբյուրներից, և ստացված գենոմային ԴՆԹ-ի քանակն ու մաքրությունը ներկայացված են հետևյալ աղյուսակում.
Օրինակ 2. Հյուսվածքների ՌՆԹ-ի արդյունահանման արդյունք և մաքրություն

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) մշակված տարբեր հյուսվածքների նմուշներ, և ստացված ՌՆԹ-ի քանակությունն ու մաքրությունը ներկայացված են ստորև բերված աղյուսակում (մկների հյուսվածքի համար).
Այնուամենայնիվ, մի կարծեք, որ դուք ավարտել եք OD արժեքը:Ունե՞ք հոգ տանել այն հիմնական կետերի մասին, որոնք ես նկարել եմ ձեզ համար առջևում:

Ծանուցում

Կտրված նուկլեինաթթվի մոլեկուլները նույնպես կհաշվարկվեն կլանման մեջ:Ենթադրելով, որ դուք ունեք գենոմային ԴՆԹ-ի մնացորդներ ՌՆԹ-ում, ձեր OD-ի արժեքը կթվա շատ բարձր, բայց ՌՆԹ-ի իրական կոնցենտրացիան հնարավոր չէ որոշել:Անկախ նրանից, թե արդյոք ձեր ՌՆԹ-ն է, պարզ չէ, թե արդյոք կա դեգրադացիա, ուստի մեզ դեռ պետք է համապարփակ գնահատման մեթոդ՝ ավելի ճշգրիտ դատողություն տալու համար, այսինքն՝ MIQE-ում նշված նուկլեինաթթվի ամբողջականության գնահատումը: