Ավանդական հակադարձ տրանսկրիպտազները չեն կարող հանդուրժել բարձր ջերմաստիճանը (MMLV-ի գործունեության օպտիմալ ջերմաստիճանը 37-50°C է, իսկ AMV-ն 42-60°C է):Ավելի բարդ վիրուսային ՌՆԹ-ն չի կարող արդյունավետ կերպով հակադարձ տառադարձվել cDNA-ի ցածր ջերմաստիճաններում, ինչը հանգեցնում է հայտնաբերման արդյունավետության նվազեցմանը:Ավանդական RT-qPCR-ն, ընդհանուր առմամբ, պահանջում է երկու հիմնական ֆերմենտների (հակադարձ տրանսկրիպտազ և ԴՆԹ պոլիմերազ) մասնակցություն, ինչը անհնարին է դարձնում ռեակցիայի համակարգի աշխատանքը պարզեցնելը և ծախսերը նվազեցնելը:Այստեղ մենք կներկայացնենք երկու բարձր ջերմաստիճանի դիմացկուն հակադարձ տրանսկրիպտազներ՝ TtH և RevTaq:Այս երկու ֆերմենտներն ունեն նաև ԴՆԹ պոլիմերազի ֆունկցիա, ուստի դրանք կոչվում են երկֆունկցիոնալ ֆերմենտներ։

TtH ԴՆԹ պոլիմերազ

Դուք հավանաբար լսել եք TtH-ի մասին, որը ստացվում է Thermus thermophilus HB8 ջերմաֆիլ բակտերիայից։Երկվալենտ կատիոնների առկայության դեպքում, ինչպիսին է Mg2+, այն ունի ԴՆԹ պոլիմերազային ակտիվություն։Այն լայնորեն օգտագործվում է PCR ռեակցիաներում, ինչպիսին է Taq ֆերմենտը, բայց այն ունի ավելի բարձր ջերմակայունություն, քան Taq ֆերմենտը, ուստի այն նաև ավելի լավ է ազդում PCR-ի վրա GC-ի բարձր պարունակությամբ կաղապարներով:

· Այս ֆերմենտը հիմնականում չունի 3'→5' էկզոնուկլեազային ակտիվություն և 5'→3' էկզոնուկլեազային ակտիվություն, ուստի այն կարող է օգտագործվել նաև դիդեօքսի հաջորդականության համար:

· Այս ֆերմենտը ունի RTase ակտիվություն:Mn2+-ի առկայության դեպքում RTase-ի ակտիվությունը կբարձրանա:Օգտագործելով այս հատկությունը, այն կարող է օգտագործվել հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիան և ՊՇՌ ռեակցիան նույն խողովակում, այսինքն՝ մեկ քայլով RT-PCR-ում իրականացնելու համար:Սակայն Mn2+-ի առկայության դեպքում RT-PCR-ի ճշգրտությունը բարձր չէ:RT ակտիվությունը կապ չունի rnaase H գործունեության հետ:

· Tth-DNA պոլիմերազի ավելացված ակտիվությունը (pH9, օպտիմալ +55℃~70℃, առավելագույնը +95℃) հաղթահարում է ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքով առաջացած խնդիրները:Ստացված cDNA-ն կարող է Amplified PCR-ի միջոցով նույն ֆերմենտով Mg2+ իոնների առկայության դեպքում:

· Tth-DNA պոլիմերազի կարողությունը կատարել հակադարձ տրանսկրիպցիա և ԴՆԹ-ի ուժեղացում բարձր ջերմաստիճաններում, այս ֆերմենտը օգտակար է դարձնում RT-PCR քանակական, կլոնավորման և բջջային և վիրուսային ՌՆԹ-ի գենային արտահայտման վերլուծության համար:
· Tth-DNA պոլիմերազը օգտագործվում է RT-PCR-ի համար՝ ՌՆԹ-ն մինչև 1կբ ուժեղացնելու համար:

Առանձնահատկություններ և առավելություններ

Tth ԴՆԹ պոլիմերազա:

• Ապահովել օպտիմիզացված պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (PCR) արտադրանքի չափը, առնվազն 1000 bp RT-PCR ռեակցիայում:

• Ընդունել մոդիֆիկացված դեզօքսիռիբոնուկլեոզիդ տրիֆոսֆատը որպես սուբստրատ

• Կապված չէ RNase H ակտիվության հետ

• Ունի բարձր ջերմային կայունություն՝ խնդիրները հաղթահարելու համար, որոնք սովորաբար կապված են ՌՆԹ-ում առկա բարձր երկրորդական կառուցվածքի հետ

RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազ

Ջերմակայուն ԴՆԹ պոլիմերազ՝ հակադարձ տրանսկրիպտազային ակտիվությամբ

RevTaq-RT-PCR-DNA պոլիմերազը մշակված, բարձր ջերմակայուն, երկֆունկցիոնալ ֆերմենտ է՝ հակադարձ տրանսկրիպտազի և ԴՆԹ պոլիմերազային ակտիվությամբ, որը ստացվում է ուղղորդված և արհեստական ​​էվոլյուցիայի միջոցով:

· RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազի կես կյանքը 95°C-ում 40 րոպեից ավելի է:

· RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազը թույլ է տալիս բարձր ջերմաստիճանի հակադարձ արտագրում անմիջապես ՌՆԹ կաղապարից, և հակադարձ տառադարձման քայլը կարող է կրկնվել մի քանի անգամ՝ ավելի շատ cDNA կաղապարներ առաջացնելու համար:

· RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազը թույլ է տալիս «զրոյական» RT-PCR (առանց իզոթերմային հակադարձ տրանսկրիպցիայի քայլ), քանի որ ցիկլային PCR ընդլայնման քայլում հակադարձ տրանսկրիպցիան և ԴՆԹ-ի ուժեղացումը տեղի են ունենում միաժամանակ:Սա նաև խթանում է հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիան բարձր ջերմաստիճաններում՝ դրանով իսկ նվազագույնի հասցնելով բարձր ջերմաստիճաններում ՌՆԹ-ի ուժեղ երկրորդական կառուցվածքի հալման հետ կապված խնդիրները:

· Շնորհիվ ապտամերների վրա հիմնված տաք մեկնարկի բանաձևի, RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազը ավելի լավ արդյունքներ կտա, երբ եռացման և երկարացման ջերմաստիճանը 57°C-ից բարձր է:

· Քանի որ ֆերմենտը ջերմակայուն է, խորհուրդ է տրվում նախագծել հալման շատ բարձր ջերմաստիճան ունեցող պրայմերներ և զոնդեր (>60°C):

· Առաջարկվում է օպտիմիզացնել եռացման/երկարացման փուլի ջերմաստիճանը ջերմաստիճանի գրադիենտի միջոցով ռեակցիայի տեղադրման գործընթացում:

· Որքան բարձր է ջերմաստիճանը, այնքան բարձր է PCR-ի առանձնահատկությունը:Հակադարձ տրանսկրիպցիայի ցիկլը սովորաբար կատարվում է ավելի բարձր ջերմաստիճանում, քան PCR ցիկլը, քանի որ ԴՆԹ Primer:RNA Կաղապարի հիբրիդացումը սովորաբար ունի ավելի բարձր հալման կետ, քան ԴՆԹ Primer:cDNA Կաղապարի դուպլեքսը:

· RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազը գենետիկորեն մշակված և օպտիմիզացված է, և ամպլիկոնի չափը 60-300 bp է:

RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազի հայտնաբերման սահմանաչափը հասնում է 4 օրինակի/

Օպտիմալացված ռեակցիայի համակարգը (բարձր հալման կետի այբբենարանների ստեղծում) ներկայացված է նկարում:RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազի վրա հիմնված RT-PCR-ն ավելի լավ զգայունություն է ցույց տալիս, քան TaqPath 1-քայլ RT-qPCR հիմնական խառնուրդը և ավելի ցածր հայտնաբերման նմուշի նոսրացման գրադիենտ:

Ավելի շատ առավելություններ.

Արագ մեկնարկի գործառույթ → Ջերմային դենատուրացիայի սկզբնական քայլը կարելի է բաց թողնել:

Hot-start aptamer-ի բանաձև → Ապահովել 100% ֆերմենտային ակտիվություն անմիջապես և կանխել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը ցածր ջերմաստիճաններում (<57°C):

Պառակտման ֆունկցիա → ՌՆԹ-ի արդյունահանման քայլը բաց է թողնվել, քանի որ RevTaq RT-PCR ԴՆԹ պոլիմերազը կարող է նաև մշակել չմշակված ռեակցիայի նմուշները:Այն կարող է անմիջապես ոչնչացնել էուկարիոտների, բակտերիաների և վիրուսների բջջային մեմբրանները տաք RT-PCR ցիկլում:

IVD հումքի մակարդակ → բարձր որակի ստանդարտներ և չափազանց մրցունակ գներ