RNase-ը զգայուն բառ է, որը շատ ուսանողներ, ովքեր հաճախ իրականացնում են ՌՆԹ արդյունահանման փորձեր, չեն ցանկանում լսել:Լիովին զինված ՌՆԹ-ն, որը վերջնականապես արդյունահանվել էր բարձր թունավոր ռեակտիվներով՝ ֆենոլով և քլորոֆորմով, քայքայվեց:Ես չեմ հաշտվել!!!Այսօր եկեք նայենք հայտնի Ռնասեի ծագմանը:

Ռիբոնուկլեազը (RNase) կամ RNase-ը նուկլեազ է, որը կարող է հիդրոլիզացնել ՌՆԹ-ն փոքր մոլեկուլների:RNase-ը, որպես փոքր մոլեկուլային սպիտակուց, անսովոր կայուն է .Պայմանական բարձր ջերմաստիճանի և բարձր ճնշման գոլորշու ստերիլիզացումը և սպիտակուցի ինհիբիտորները չեն կարող ամբողջությամբ ապաակտիվացնել այն:RNase-ի կայունությունը հիմնականում գալիս է կառուցվածքի դիսուլֆիդային կապերից։Օրինակ, տավարի ենթաստամոքսային գեղձի սովորաբար օգտագործվող RNase-ն ունի ընդամենը 124 ամինաթթու, բայց պարունակում է 4 դիսուլֆիդային կապ:Ծծմբային կապը և դիսուլֆիդային կապը RNase-ին տալիս են գերազանց ջերմային կայունություն:Բացի այդ, rnase-ն ունի համեմատաբար փոքր մոլեկուլային քաշ և շատ դեպքերում կարող է արագ վերականգնել իր սկզբնական կոնֆորմացիան:

Բացի չափազանց կայուն լինելուց,ՌՆազները լաբորատորիայում ամենուր են .RNase-ը կենսաբանական պաշտպանական մեխանիզմ է:Բջջի համար էկզոգեն ՌՆԹ-ն հաճախ մահացու է:Էկզոգեն ԴՆԹ-ի համեմատությամբ, էկզոգեն ՌՆԹ-ն հաճախ ավելի վտանգավոր է:ՌՆԹ-ն ուրախությամբ արտագրվում և թարգմանվում է, ուստի գրեթե բոլոր օրգանիզմները զարգացրել են RNase-ներ՝ պաշտպանվելու էկզոգեն ՌՆԹ-ի ներխուժումից:Հետևաբար, լաբորատորիայում մշակված բակտերիալ բջիջները և դուք, ով արդյունահանում եք ՌՆԹ, արտանետում է RNase-ի բույրը:Մարդու մարմնի հեղուկները (թուք, արցունքներ և այլն) պարունակում են մեծ քանակությամբ RNase, այնպես որ մի լացեք, երբ ՌՆԹ-ն քայքայվում է:Որքան շատ եք լացել, այնքան ավելի վատ է ՌՆԹ-ի քայքայումը:!Քույր Դայյուն հարմար չէ ՌՆԹ արդյունահանման համար:

Բացի այդ, ձեր նուրբ մաշկը պարունակում է նաև շատ RNase, իսկ մարկերները, պիպետները, սառնարանի դռները և դռների բռնակները, որոնց մաշկը դիպչել է, նույնպես պարունակում են RNase:

Այսքան թափառումներով, եկեք նայենք, թե ինչպես վարվել RNase-ների հետ:

Առաջին բանը, որ բոլորը մտածում են ՌՆԹ-ն հեռացնելիս, դա էDEPC(դիէթիլ պիրոկարբոնատ):DEPC-ն հիմնականում դենատուրացնում է սպիտակուցը՝ միանալով RNase ակտիվ խմբի հիստիդինի իմիդազոլ օղակի հետ՝ դրանով իսկ արգելելով ֆերմենտի ակտիվությունը:0.1% DEPC-ն կարող է ավելի լավ հեռացնել Rnase-ի ազդեցությունը, սակայն մենք պետք է ուշադրություն դարձնենք, որ DEPC-ն հայտնի քաղցկեղածին է, ուստի այն օգտագործելիս պետք է հատուկ ուշադրություն դարձնել:

RNase-ի համար մենք պետք է սկսենք երկու ասպեկտներից.առաջինը էնդոգեն RNase-ի ակտիվության արգելակումն է

ՌՆԹ-ի արդյունահանման սովորական ռեակտիվները, ինչպիսիք են գուանիդին իզոթիոցիանատը և DTT-ը, որոնք պարունակվում են Trizol-ում, կարող են բացել RNase-ի դիսուլֆիդային կապը, սակայն դեռևս կան որոշ RNases, հատկապես հյուսվածքների նմուշներում, ուստի ուշադրություն դարձրեք ցածր ջերմաստիճանին:

1.Հյուսվածքի նմուշը հանելուց հետո անմիջապես ընկղմեք հեղուկ ազոտի կամ առևտրային ՌՆԹ-ի պահպանման լուծույթի մեջ:

2.Բջջային նմուշի ՌՆԹ-ն արդյունահանելուց հետո այն ավելացրեք լուծույթի լուծույթին և լուծեք այն սառցե տուփի վրա:

3. Ավելի լավ է օգտագործել հեղուկ ազոտը մանրացման համար երբ հյուսվածքների նմուշները համասեռացված են:Առանց հեղուկ ազոտի էլեկտրական հոմոգենիզատոր օգտագործելիս ուշադրություն դարձրեք հոմոգենատ ադապտերը լիովին նախապես հովացնելուն:

Երկրորդը էկզոգեն DNase է

1.Եղեք ամբողջությամբ զինված, հագեք լաբորատոր վերարկու, հագեք դիմակ և անպայման կրեք մի զույգ նոր ձեռնոց (այդքան խնայող մի եղեք!! Պետք է նշել, որ Trizol-ը գերքայքայիչ է, ինչպես նաև շատ ամուր է ձեռնոցների միջոցով, այնպես որ ձեռքերի վրա մի կաթեք):

2.Բոլոր օգտագործված պիպետտի ծայրերը, EP խողովակները, PCR խողովակները և այլ սարքավորումները պետք է վերամշակվեն RNase-ով:Այն կարող է ներծծվել 0.1% DEPC-ով, այնուհետև ճնշվել բարձր ճնշման տակ:Ուշադրություն դարձրեք ծխախոտի շահագործմանը:Տեղական բռնակալները կարող են ուղղակիորեն սպառվող նյութեր գնել ֆերմենտները հեռացնելու համար:

Հ.Գ. Մի ծույլ մեթոդ ասեմ.Չնայած բարձր ջերմաստիճանը և բարձր ճնշումը չեն կարող ամբողջությամբ հեռացնել RNase-ը, այն կհեռացնի դրա մեծ մասը:2 անգամ բարձր ջերմաստիճանը և բարձր ճնշումը լավ ազդեցություն է ունենում, իսկ ՌՆԹ-ի արդյունահանումը քիչ ազդեցություն ունի։

3.Ալկոհոլը կարող է այլասերել սպիտակուցները,այնպես որ ՌՆԹ-ի արդյունահանման աղյուսակը կարելի է սրբել 75% ալկոհոլով , իսկ ձեռնոցները նույնպես կարելի է ցողել սպիրտով։

4.ՌՆԹ-ի լուծարման վերջնական լուծույթը և ցենտրիֆուգային խողովակը նույնպես պետք է մշակվեն դե-ՌՆազով:DEPC ջուրը սովորաբար օգտագործվող ՌՆԹ լուծարող լուծույթ է:Եկեք խոսենք DEPC ջրի ճիշտ պատրաստման եղանակի մասին (հիշեք, որ այն գնելիս պետք է վերափաթեթավորեք առևտրային DEPC-ը)

Ավելացրեք DEPC ուլտրամաքուր ջրին 1:1000-ին, լավ թափահարեք, թողեք գիշերը մնա 37°C ջերմաստիճանում և 121°C ստերիլիզացրեք բարձր ջերմաստիճանի և բարձր ճնշման տակ 15 րոպե:DEPC ջուրը կարող է պահվել -20°C ջերմաստիճանում 1 մլ չափաբաժիններով:

Վերջապես, ամփոփելու համար. ցածր ջերմաստիճանը բանալին է, ծախսվող նյութերը լավ են վարվում, լիովին զինված և քիչ խոսակցություններ:

Դե, դա այսօրվա ռազմավարության համար է:Մաղթում եմ ձեզ ձեր նշած ՌՆԹ-ի ողջ կոնցենտրացիան և մաքրությունը:Երկու A260/A280-ն էլ 2.0 են:!!

Իհարկե, եթե դուք օգտագործում եք ասենյակային ջերմաստիճանում գործող ՌՆԹ արդյունահանման հավաքածու, հնարավոր է՝ չհանդիպեք վերը նշված անախորժություններին։

Սենյակային ջերմաստիճանում աշխատելը, առանց DNase ավելացնելու, բջիջներից ընդհանուր ՌՆԹ-ն հանում է 11 րոպեում, իսկ ընդհանուր ՌՆԹ-ն կենդանական հյուսվածքներից կամ բույսերից 30 րոպեում:

Փորձնական նմուշների համար դիմեք՝overseas@foregene.com

Առնչվող ապրանքներ.

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/