Fluorescence quantitative PCR (նաև հայտնի է որպես TaqMan PCR, այսուհետ՝ FQ-PCR) նոր նուկլեինաթթվի քանակական տեխնոլոգիա է, որը մշակվել է PE (Perkin Elmer) կողմից ԱՄՆ-ում 1995 թվականին: Այս տեխնոլոգիան հիմնված է սովորական PCR-ի վրա՝ ավելացնելով լյումինեսցենտային պիտակավորված զոնդեր:Ճկուն ՊՇՌ-ի համեմատությամբ՝ FQ-PCR-ն ունի բազմաթիվ առավելություններ իր քանակական ֆունկցիան իրականացնելու համար:Այս հոդվածը նախատեսում է համառոտ նկարագրել տեխնոլոգիայի բնութագրերը, սկզբունքները, մեթոդները և կիրառությունները:

1 Հատկանիշներ

FQ-PCR-ն ունի ոչ միայն սովորական PCR-ի բարձր զգայունությունը, այլ նաև լյումինեսցենտային զոնդերի կիրառման շնորհիվ այն կարող է ուղղակիորեն հայտնաբերել լյումինեսցենտային ազդանշանի փոփոխությունը PCR ուժեղացման ժամանակ ֆոտոէլեկտրական հաղորդման համակարգի միջոցով՝ քանակական արդյունքներ ստանալու համար, ինչը հաղթահարում է սովորական PCR-ի բազմաթիվ թերություններ, ուստի ունի նաև բարձր սպեկտրականություն և ԴՆԹ-ի բարձր ճշգրտություն:

Օրինակ, ընդհանուր PCR արտադրանքները պետք է դիտարկվեն ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզով և էթիդիումի բրոմիդով ներկելով ուլտրամանուշակագույն լույսով կամ պոլիակրիլամիդ գելային էլեկտրոֆորեզով և արծաթի ներկումով:Սա ոչ միայն պահանջում է բազմաթիվ գործիքներ, այլև ժամանակ և ջանք է պահանջում:Էթիդիումի բրոմիդ օգտագործվող բծերը վնասակար են մարդու մարմնի համար, և այս բարդ փորձարարական ընթացակարգերը հնարավորություն են տալիս աղտոտման և կեղծ պոզիտիվների համար:Այնուամենայնիվ, FQ-PCR-ին անհրաժեշտ է միայն մեկ անգամ բացել կափարիչը նմուշի բեռնման ժամանակ, և հետագա գործընթացը ամբողջովին փակ խողովակի աշխատանք է, որը չի պահանջում PCR հետմշակում, խուսափելով սովորական PCR գործողությունների բազմաթիվ թերություններից:Փորձը հիմնականում օգտագործում է ABI7100 PCR ջերմային ցիկլեր, որը մշակվել է PE ընկերության կողմից:

Գործիքը ունի հետևյալ բնութագրերը. ① Լայն կիրառություն. Այն կարող է օգտագործվել ԴՆԹ և ՌՆԹ PCR արտադրանքի քանակականացման, գեների արտահայտման հետազոտության, պաթոգենների հայտնաբերման և PCR պայմանների օպտիմալացման համար:② Եզակի քանակական սկզբունք. Օգտագործելով լյումինեսցենտային պիտակավորված զոնդերը, լազերային գրգռումից հետո ֆլյուորեսցենտային քանակությունը կկուտակվի PCR ցիկլի հետ, որպեսզի հասնի քանակականացման նպատակին:③ Աշխատանքային բարձր արդյունավետություն. Ներկառուցված 9600 PCR ջերմային ցիկլեր, համակարգչով կառավարվող 1-ից 2 ժամ տևողությամբ 96 նմուշների ուժեղացումն ու քանակականացումը ավտոմատ և համաժամանակ ավարտելու համար:④ Գելային էլեկտրոֆորեզի կարիք չկա. Նմուշը նոսրացնելու և էլեկտրոֆորեզի կարիք չկա, պարզապես օգտագործեք հատուկ զոնդ՝ անմիջապես ռեակցիայի խողովակում հայտնաբերելու համար:⑤ Խողովակաշարում աղտոտվածություն չկա. եզակի ամբողջությամբ փակ ռեակցիոն խողովակը և ֆոտոէլեկտրական հաղորդման համակարգը ընդունված են, ուստի աղտոտվածության մասին անհանգստանալու կարիք չկա:⑥ Արդյունքները վերարտադրելի են. քանակական դինամիկ միջակայքը մինչև հինգ կարգի մեծության է:Հետևաբար, քանի որ այս տեխնոլոգիան հաջողությամբ մշակվել է, այն գնահատվել է բազմաթիվ գիտաշխատողների կողմից և կիրառվել բազմաթիվ ոլորտներում:

2 Սկզբունքներ և մեթոդներ

FQ-PCR-ի աշխատանքի սկզբունքն է օգտագործել Taq ֆերմենտի 5'→3' էկզոնուկլեազային ակտիվությունը՝ PCR ռեակցիայի համակարգին լյումինեսցենտով պիտակավորված զոնդ ավելացնելու համար:Զոնդը կարող է հատուկ հիբրիդացվել ԴՆԹ-ի կաղապարի հետ, որը պարունակվում է այբբենարանի հաջորդականության մեջ:Զոնդի 5' վերջը պիտակավորված է ֆլյուորեսցենտային արտանետման գենով FAM (6-կարբոքսիֆլուորեսցին, ֆլուորեսցենտային արտանետման գագաթնակետը 518 նմ), իսկ 3' վերջը պիտակավորված է ֆլյուորեսցենցիայի մարման խմբով TAMRA (6-կարբոքսիտետրամեթրամեթիլռոդամին 38, զոնդը ֆոսֆորիլացված է, որպեսզի կանխվի զոնդի երկարացումը PCR ուժեղացման ժամանակ:Երբ զոնդը մնում է անձեռնմխելի, հանգցնող խումբը ճնշում է արտանետվող խմբի ֆլյուորեսցենտային արտանետումը:Երբ արտանետվող խումբը անջատվում է մարման խմբից, արգելակումը վերացվում է, և օպտիկական խտությունը 518 նմ-ում մեծանում է և հայտնաբերվում է ֆլյուորեսցենտային հայտնաբերման համակարգով: Վերաստեղծման փուլում զոնդը հիբրիդացվում է կաղապարի ԴՆԹ-ի հետ, իսկ Taq ֆերմենտը կաղապարի պրիմերային փուլում շարժվում է երկարացման երկայնքով:Երբ զոնդն անջատվում է, հանգցման էֆեկտն ազատվում է, իսկ լյումինեսցենտային ազդանշանը թողարկվում է:Ամեն անգամ, երբ կաղապարը պատճենվում է, զոնդն անջատվում է, որն ուղեկցվում է լյումինեսցենտային ազդանշանի արձակմամբ:Քանի որ կա մեկ առ մեկ փոխհարաբերություն թողարկված ֆտորոֆորների և PCR արտադրանքների քանակի միջև, այս տեխնիկան կարող է օգտագործվել ձևանմուշը ճշգրիտ քանակականացնելու համար:Փորձարարական գործիքը հիմնականում օգտագործում է ABI7100 PCR ջերմային ցիկլեր, որը մշակվել է PE ընկերության կողմից, և կարող են օգտագործվել նաև այլ ջերմային ցիկլեր:Եթե ​​փորձի համար օգտագործվում է ABI7700 ռեակցիայի տիպի ռեակցիայի համակարգը, ռեակցիան ավարտելուց հետո քանակական արդյունքները կարող են ուղղակիորեն տրվել համակարգչային վերլուծության միջոցով:Եթե ​​դուք օգտագործում եք այլ ջերմային ցիկլեր, դուք պետք է օգտագործեք ֆլյուորեսցենտային դետեկտոր՝ ռեակցիայի խողովակում ֆլյուորեսցենտային ազդանշանը միաժամանակ չափելու համար՝ RQ+, RQ-, △RQ հաշվարկելու համար:RQ+-ը ներկայացնում է նմուշի խողովակի լյումինեսցենտային արտանետման խմբի լյումինեսցենտային ինտենսիվության հարաբերակցությունը մարման խմբի լյումինեսցենցիայի ինտենսիվությանը, RQ- ներկայացնում է դատարկ խողովակի երկուսի հարաբերակցությունը, կարելի է ձեռք բերել:Լյումինեսցենտային զոնդերի ներդրման շնորհիվ էականորեն բարելավվում է փորձի առանձնահատկությունը։Զոնդի դիզայնը, ընդհանուր առմամբ, պետք է համապատասխանի հետևյալ պայմաններին.②GC հիմքերի պարունակությունը կազմում է 40% և 60%՝ մեկ նուկլեոտիդային հաջորդականությունների կրկնօրինակումից խուսափելու համար:③ Խուսափեք հիբրիդացումից կամ պրայմերների հետ համընկնումից:④ Զոնդի և կաղապարի միջև կապի կայունությունն ավելի մեծ է, քան այբբենարանի և կաղապարի միջև կապի կայունությունը, ուստի զոնդի Tm արժեքը պետք է լինի առնվազն 5°C բարձր, քան այբբենարանի Tm արժեքը:Բացի այդ, զոնդի կոնցենտրացիան, զոնդի և կաղապարի հաջորդականության միջև հոմոլոգիան, ինչպես նաև զոնդի և այբբենարանի միջև եղած հեռավորությունը, բոլորն էլ ազդում են փորձարարական արդյունքների վրա:

Առնչվող ապրանքներ.

Չինաստան Lnc-RT Heroᵀᴹ I(With gDNase) (Super Premix for first-strand cDNA synthesis from lncRNA) Արտադրող և մատակարար |Foregene (foreivd.com)

Չինաստան իրական ժամանակում PCR Easyᵀᴹ-Taqman Արտադրող և Մատակարար |Foregene (foreivd.com)