qPCR փորձարկումներում այբբենարանի ձևավորումը նույնպես շատ կարևոր օղակ է:Արդյոք այբբենարանները հարմար են, թե ոչ, սերտորեն կապված է այն բանի հետ, թե արդյոք ուժեղացման արդյունավետությունը հասնում է ստանդարտին, արդյոք ուժեղացված արտադրանքները հատուկ են, և արդյոք առկա են փորձարարական արդյունքները:
Այսպիսով, ինչպե՞ս ավելի լավ դարձնել qPCR այբբենարանի առանձնահատկությունը:Բարձր ուժեղացման արդյունավետությո՞ւն:
Այսօր մենք ձեզ կտանենք միասին նախագծելու qPCR այբբենարաններ, և թույլ կտանք, որ qPCR այբբենարանների դիզայնը դառնա արդյունավետ գիտական ​​հմտություն փորձերում:
qPCR այբբենարանները նախագծելիս սովորաբար ուշադրություն դարձրեք հետևյալ կետերին. պրայմերները պետք է հնարավորինս նախագծված լինեն ինտրոններով, արտադրանքի երկարությունը պետք է լինի 100-300 bp, Tm արժեքը հնարավորինս մոտ լինի 60°C-ին, իսկ հոսանքին հակառակ և ներքևի պրայմերները պետք է հնարավորինս մոտ լինեն, իսկ այբբենարանի վերջը պետք է լինի G կամ C և այլն:
1. Ինտրոններ ընդգրկող այբբենարանների ձևավորում
qPCR պրայմերներ նախագծելիս, ինտրոնների միջով նախագծված պրայմերներ ընտրելը կարող է կանխել gDNA ձևանմուշի ուժեղացումը, և արտադրանքները բոլորը ստացվում են cDNA-ի ուժեղացումից՝ այդպիսով վերացնելով gDNA-ի աղտոտման ազդեցությունը:
2. Այբբենարանի երկարությունը
Այբբենարանի երկարությունը սովորաբար 18-30 նտ է, իսկ ուժեղացման արտադրանքի երկարությունը պետք է հնարավորինս վերահսկվի 100-300 բ/վ միջև:
Եթե ​​այբբենարանը չափազանց կարճ է, դա կհանգեցնի ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման, իսկ եթե այն չափազանց երկար է, այն հեշտությամբ կձևավորի երկրորդական կառուցվածք (օրինակ՝ մազակալի կառուցվածքը):Եթե ​​ուժեղացման արտադրանքը չափազանց երկար է, այն հարմար չէ պոլիմերազի ռեակցիայի համար, ինչը կազդի PCR ուժեղացման արդյունավետության վրա:
3. GC բովանդակությունը և Tm արժեքը
Պրայմերների GC պարունակությունը պետք է վերահսկվի 40% -ից մինչև 60%:Եթե ​​այն չափազանց բարձր է կամ շատ ցածր, դա չի նպաստում ռեակցիա սկսելու համար:Առաջնային և հակադարձ այբբենարանների GC պարունակությունը պետք է մոտ լինի նույնին, որպեսզի ստանանք նույն Tm արժեքը և եռացման ջերմաստիճանը:
Tm-ի արժեքը պետք է լինի հնարավորինս 55-65°C-ի սահմաններում, սովորաբար մոտ 60°C, իսկ հոսանքի վերևում և ներքևում գտնվող Tm-ի արժեքը պետք է լինի հնարավորինս մոտ, ցանկալի է ոչ ավելի, քան 4°C:
4. Խուսափեք A-ն ընտրելուց այբբենարանի 3′ վերջում
Երբ այբբենարանի 3' ծայրը անհամապատասխան է, տարբեր հիմքերի սինթեզի արդյունավետության մեջ մեծ տարբերություններ կան:Երբ վերջին հիմքը A է, այն կարող է նաև սկսել շղթայի սինթեզ նույնիսկ անհամապատասխանության դեպքում, իսկ երբ վերջին հիմքը T Երբ է, անհամապատասխանության ինդուկցիայի արդյունավետությունը զգալիորեն նվազում է:Ուստի աշխատեք խուսափել այբբենարանի 3′ վերջում A ընտրությունից, իսկ ավելի լավ է ընտրել T.
Եթե ​​դա զոնդի այբբենարան է, ապա զոնդի 5′ ծայրը չի կարող լինել G, քանի որ նույնիսկ այն դեպքում, երբ մեկ G բազան միացված է FAM լյումինեսցենտային ռեպորտաժի խմբին, G-ն կարող է նաև մարել FAM խմբի արձակած լյումինեսցենտային ազդանշանը, ինչը հանգեցնում է կեղծ բացասական արդյունքների:Հայտնվել.
5. Բազային բաշխում
Չորս հիմքերի բաշխումը այբբենարանում գերադասելի է պատահական՝ խուսափելով ավելի քան 3 անընդմեջ G կամ C-ից 3′ վերջում և ավելի քան 3 անընդմեջG կամ C-ն հեշտ է ստեղծել զուգավորում GC-ով հարուստ հաջորդականության շրջանում:
6. Այբբենարանի նախագծման շրջանը պետք է խուսափի բարդ երկրորդական կառույցներից:
Ուժեղացման արտադրանքի մեկ շղթայով ձևավորված երկրորդական կառուցվածքը կազդի PCR-ի սահուն առաջընթացի վրա:Նախապես կանխատեսելով, թե արդյոք թիրախային հաջորդականության մեջ կա երկրորդական կառուցվածք, փորձեք խուսափել այս շրջանից այբբենարանների նախագծման մեջ:
7. Պրայմերներն իրենք և այբբենարանների միջև պետք է փորձեն խուսափել հաջորդական փոխլրացնող հիմքերից:
Բուն այբբենարանի և այբբենարանի միջև չի կարող լինել հաջորդական 4 հիմքերի փոխլրացում:Ինքը՝ այբբենարանը, չպետք է ունենա լրացուցիչ հաջորդականություն, հակառակ դեպքում այն ​​կծալվի՝ ձևավորելով վարսահարդարիչ կառուցվածք, որը կազդի այբբենարանի և կաղապարի եռացման համադրության վրա:
Կոմպլեմենտար հաջորդականությունները չեն կարող գոյություն ունենալ հոսանքին հակառակ և ներքևի այբբենարանների միջև:Պրայմերների միջև կոմպլեմենտարությունը կստեղծի պրայմերային դիմերներ, որոնք կնվազեցնեն PCR արդյունավետությունը և նույնիսկ կազդեն քանակական ճշգրտության վրա:Եթե ​​այբբենարան-դիմեր և մազակալի կառուցվածքներն անխուսափելի են, △G արժեքը չպետք է չափազանց բարձր լինի (պետք է լինի 4,5 կկալ/մոլից պակաս):
8. Պրայմերները ուժեղացնում են թիրախային կոնկրետ արտադրանքը:
qPCR հայտնաբերման վերջնական նպատակն է հասկանալ թիրախային գենի առատությունը:Եթե ​​ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում է տեղի ունենում, քանակականացումը կլինի ոչ ճշգրիտ:Հետևաբար, այբբենարանների նախագծումից հետո դրանք պետք է փորձարկվեն BLAST-ով, և արտադրանքի առանձնահատկությունները համեմատվեն հաջորդականության տվյալների բազայում:
Այնուհետև մենք վերցնում ենք մարդու GAS6 (աճի դադարեցման հատուկ 6) գենը որպես օրինակ qPCR պրայմերներ նախագծելու համար:
01 հարցման գեն
Homo GAS6NCBI-ի միջոցով:Այստեղ մենք պետք է ուշադրություն դարձնենք գենի անվան և տեսակների համեմատությանը, որպեսզի համոզվենք, որ դրանք համահունչ են:
02 Գտեք գեների հաջորդականությունը
(1) Եթե թիրախային հաջորդականությունը գենոմային ԴՆԹ-ն է, ընտրեք առաջինը, որը գենի գենոմային ԴՆԹ-ի հաջորդականությունն է:
(2) Եթե թիրախային հաջորդականությունը mRNA է, ընտրեք երկրորդը:Մուտք գործելուց հետո սեղմեք «CDS» ստորև բերված աղյուսակում:Շագանակագույն ֆոնային հաջորդականությունը գենի կոդավորման հաջորդականությունն է:
03 Դիզայնի այբբենարաններ
Մուտքագրեք Primer-BLAST ինտերֆեյսը
Վերևի ձախ կողմում մուտքագրեք գեների հաջորդականության համարը կամ հաջորդականությունը Fasta ձևաչափով և լրացրեք համապատասխան պարամետրերը:

Կտտացրեք «Ստացեք այբբենարաններ» և NCBI-ն կհայտնվի ձեզ, որ նման պարամետրերի ընտրությունը կուժեղացվի միացման այլ տարբերակների հետ:Մենք կարող ենք ստուգել միացման տարբեր տարբերակները և ներկայացնել դրանք համապատասխան այբբենարանի զույգ ստանալու համար (ինչպես ցույց է տրված ստորև նկարում):Այս գործընթացը կարող է տևել տասնյակ վայրկյաններ:
Այս այբբենարանի զույգերի եռացման ջերմաստիճանը մոտ 60°C է:Ըստ փորձի նպատակի, փորձի համար ընտրեք միջին երկարությամբ, լավ սպեցիֆիկությամբ և այբբենարանների ավելի քիչ ինքնալրացում ունեցող պրայմերներ, և հաջողության գործակիցը բավականին բարձր է:
04 Այբբենարանի առանձնահատկությունների ստուգում
Փաստորեն, Primer-Blast-ը, բացի պրայմերների նախագծումից, կարող է նաև գնահատել այն այբբենարանները, որոնք մենք ինքներս ենք նախագծել:Վերադարձեք այբբենարանի ձևավորման էջ, մուտքագրեք մեր նախագծած վերին և ներքևի այբբենարանները, և մյուս պարամետրերը չեն ճշգրտվի:Ներկայացնելուց հետո դուք կարող եք տեսնել, թե արդյոք զույգ պրայմերները գոյություն ունեն նաև այլ գեների վրա:Եթե ​​դրանք բոլորը դրսևորվեն գենի վրա, որը մենք ցանկանում ենք ուժեղացնել, ինչը ցույց է տալիս, որ այս զույգ պրայմերների առանձնահատկությունը մեծ է:(Օրինակ, սա այբբենարանի հարցման միակ արդյունքն է):

05 Այբբենարանի որակի դատողություն
Ինչպիսի՞ այբբենարան է «կատարյալ» այբբենարանը, որը միավորում է «ուժեղացման արդյունավետությունը մինչև ստանդարտ», «ուժեղացված արտադրանքի բնութագրերը» և «հուսալի փորձնական արդյունքները»:
Ուժեղացման արդյունավետություն

հալման կորը
Պրայմերների ուժեղացման արդյունավետությունը հասնում է 90%-110%, ինչը նշանակում է, որ ուժեղացման արդյունավետությունը լավ է, իսկ հալման կորը ունի մեկ գագաթ և սովորաբար Tm>80°C, ինչը նշանակում է, որ ուժեղացման առանձնահատկությունը լավ է։
 
Առնչվող ապրանքներ.
Իրական ժամանակում PCR Easy–SYBR GREEN I
Իրական ժամանակում PCR Easy-Taqman