Իրական ժամանակում PCR պրայմերների նախագծման սկզբունքները

Forward Primer և Reverse Primer

Իրական ժամանակում PCR-ի համար այբբենարանի ձևավորումը շատ կարևոր է:Պրայմերները կապված են PCR ուժեղացման առանձնահատկությունների և արդյունավետության հետ և կարող են նախագծվել հետևյալ սկզբունքներով.

Այբբենարանի երկարությունը՝ 18-30bp:

GC պարունակությունը՝ 40-60%:

Tm արժեքը. Primer նախագծման ծրագրակազմը, ինչպիսին է Primer 5-ը, կարող է տալ այբբենարանի Tm արժեքը:Վերև և ներքև գտնվող այբբենարանների Tm արժեքները պետք է հնարավորինս մոտ լինեն:Կարող է օգտագործվել նաև Tm հաշվարկման բանաձևը՝ Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T):PCR-ն իրականացնելիս որպես եռացման ջերմաստիճան սովորաբար ընտրվում է պրայմերային Tm արժեքից ցածր 5 °C ջերմաստիճան (եռացման ջերմաստիճանի համապատասխան աճը կարող է մեծացնել PCR ռեակցիայի առանձնահատկությունը):

Պրայմերներ և PCR արտադրանք.

Դիզայնի այբբենարան PCR ուժեղացման արտադրանքի երկարությունը նախընտրելի է 100-150 bp:

Կաղապարի երկրորդական կառուցվածքային տարածքում նախագծային այբբենարանները պետք է հնարավորինս խուսափել:

Խուսափեք 2 կամ ավելի փոխլրացնող հիմքերի ձևավորումից վերև և ներքև գտնվող այբբենարանների 3' ծայրերի միջև:

Primer 3′ տերմինալային հիմքը չի կարող առկա լինել 3 լրացուցիչ հաջորդական G կամ C-ով:

Պրայմերներն իրենք չեն կարող ունենալ լրացուցիչ կառուցվածքներ, հակառակ դեպքում կձևավորվի մազակալի կառուցվածք, որը կազդի PCR ուժեղացման վրա:

ATCG-ն պետք է հնարավորինս հավասարաչափ բաշխվի այբբենարանի հաջորդականությամբ, և 3' տերմինալային հիմքը պետք է խուսափել, քանի որ T.

Հավելված 1:Cell Direct RT-qPCR Kit բաղադրիչի հավելումների փաթեթ

1.Բջջային լիզի լուծույթ