RT-qPCR-ն մոլեկուլային կենսաբանության հիմնական փորձն է, և բոլորը պետք է ծանոթ լինեն դրան:Այն հիմնականում ներառում է երեք քայլ՝ ՌՆԹ-ի արդյունահանում, հակադարձ տառադարձում cDNA-ի և իրական ժամանակի ֆլուորեսցենտային քանակական PCR:Չի օգնում, ի՞նչ է կատարվում։Հավանական է, որ խնդիր կահակադարձ արտագրման փորձ!Չնայած թվում է, որ հակադարձ տառադարձման փորձին անհրաժեշտ է միայն ավելացնել ՌՆԹ, dNTP, պրայմերներ ևհակադարձ տրանսկրիպտազդեպի ցենտրիֆուգային խողովակը և լավ խառնել, բայց իրական շահագործման գործընթացում դեռ շատ մանրամասներ կան, որոնց վրա պետք է ուշադրություն դարձնել:Եկեք սովորենք դրա մասին:

Ինչպե՞ս դատել ՌՆԹ-ի որակը:
cDNA ստանալու համար ՌՆԹ-ի որակը կարևոր է:ՌՆԹ-ի որակը կարելի է հայտնաբերել հիմնականում երկու տեսանկյունից.
(1) ՌՆԹ ամբողջականություն.ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը կարելի է ստուգել ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզի միջոցով. Որպես օրինակ վերցնելով էուկարիոտները, ամբողջական ընդհանուր ՌՆԹ-ն ունի երեք հստակ գոտի, մոլեկուլային կշիռները մեծից փոքր են 28S, 18S և 5S, իսկ 28S-ը երկու անգամ ավելի պայծառ է, քան 18S-ը;եթե երևում են երեք գոտի, բայց ժապավենի տեսակը մշուշոտ է կամ Դիֆուզիան նշանակում է, որ ՌՆԹ-ն մասամբ քայքայված է:Այս պահին խնդրում ենք անհապաղ կատարել հակադարձ տառադարձման ռեակցիան և պատշաճ կերպով մեծացնել կաղապարի մուտքագրումը.եթե միայն փոքր մոլեկուլային քաշով կամ առանց գոտի կարելի է տեսնել, ՌՆԹ-ն ամբողջությամբ քայքայվել է և պետք է նորից արդյունահանվի:Agilent 2100-ը ցույց է տալիս ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը առավելագույն դիագրամով և RIN արժեքով:Եթե ​​նուկլեինաթթուն անփոփոխ է, ապա էլեկտրոֆերոգրամի ելակետը հարթ է.եթե նուկլեինաթթուն խիստ քայքայված է, ելակետը անհավասար է, և ավելի շատ քայքայման գագաթներ են հայտնվում.RIN-ի արժեքը արտացոլում է ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը, 0-10 միջակայքում, որքան մեծ է արժեքը, այնքան լավ է ՌՆԹ-ի որակը:Դե, այնքան բարձր է ամբողջականության աստիճանը:
(2) ՌՆԹ-ի մաքրությունը.OD260/280 հարաբերակցությունը կարելի է հայտնաբերել ուլտրամանուշակագույն սպեկտրոֆոտոմետրիայի միջոցով:Եթե ​​OD260/280 հարաբերակցությունը 1.9-ից 2.1-ի միջև է, ապա մաքրությունը շատ լավ է:
Գենոմային ԴՆԹ-ի մնացորդը կարող է հանգեցնել ոչ ճշգրիտ քանակական արդյունքների
Երբ ՌՆԹ-ն արդյունահանվում է, մեր ստացած ՌՆԹ-ն կարող է խառնվել գենոմային ԴՆԹ-ին (gDNA), որը չի մաքրվել:Հետևաբար, հակադարձ արտագրումից հետո cDNA-ն նույնպես կխառնվիgDNA.Ընթացքում վարqPCRռեակցիա,cDNAև gDNA-ն կարող են միաժամանակ ուժեղացվել, ինչը հանգեցնում է համեմատաբար փոքր CT արժեքի, ուստի արդյունքները կարող են կողմնակալ լինել:
Այսպիսով, ինչ պետք է անենք այս իրավիճակում:Foregeneառաջարկում է.
(1) Կատարել գենոմի մաքրում հակադարձ ՌՆԹ-ի վրա, որը կարող է հեռացվել ՌՆԹ-ի արդյունահանման ընթացքում սյունակի արդյունահանմամբ.
(2) Արդյունահանված ՌՆԹ-ն մշակեք DNase-ովI , բայց դադարեցրեք այն EDTA-ով;
հակադարձ տառադարձման ռեակտիվներիգենոմի մաքրման մոդուլներով;

Ինչպե՞ս ընտրել այբբենարաններ հակադարձ տառադարձման համար:
Հակադարձ տրանսկրիպցիայի այբբենարանները նույնպես ազդում են հակադարձ տառադարձման ռեակցիայի արդյունքի վրա:Դուք կարող եք ընտրել պատահական պրայմերներ, Oligo dT կամ գենային հատուկ այբբենարաններ հակադարձ տառադարձման համար՝ ըստ փորձի հատուկ հանգամանքների.
(1) Հատուկ արտագրություններԱռաջարկվում են գենային հատուկ պրայմերներ;
(2) Երկար հատվածի արտագրություններԱռաջարկվում են օլիգո dT/գենային հատուկ պրայմերներ;
(3) Երկար հատվածի արտագրությունների ներքին բեկորներգենային հատուկ պրայմերներ/ պատահական այբբենարաններ /պատահական պրայմերներ + Oligo dT:Եթե ​​հետագա qPCR փորձը կատարվի, Oligo dT-ն չի կարող օգտագործվել միայնակ, քանի որ միայնակ Oligo dT-ի օգտագործումը կարող է առաջացնել 3' վերջի կողմնակալություն, ինչը կհանգեցնի qPCR փորձի ոչ ճշգրիտ արդյունքների.
(4) miRNAԿարող են օգտագործվել ցողունային այբբենարաններ կամ պոչամբարներ:

Քանի՞ անգամ պետք է նոսրացնել հակադարձ արտագրման արտադրանքի cDNA-ն քանակականացման համար:
Հակադարձ արտագրման արտադրանքի cDNA-ն ստանալուց հետո շատ կարևոր է, թե քանի անգամ cDNA-ն պետք է նոսրացվի qPCR փորձերի համար:Եթե ​​cDNA-ի կոնցենտրացիան չափազանց բարձր կամ շատ ցածր է, ուժեղացման արդյունավետությունը կարող է ազդել:Հնարավո՞ր է չափել cDNA-ի կոնցենտրացիան և ինչպե՞ս դա անել:
(1) Հակադարձ տրանսկրիպցիայի արտադրանքի cDNA կոնցենտրացիան չի կարող չափվել, քանի որ ի լրումն cDNA արտադրանքի, հակադարձ տառադարձման արտադրանքը պարունակում է նաև հակադարձ տրանսկրիպցիայի մնացորդային բուֆեր, հակադարձ տրանսկրիպտազ, պրայմերներ և այլն, որոնք կխանգարեն կոնցենտրացիայի չափման արդյունքներին և կառաջացնեն OD260/280, OD260, abnotrat and OD200D:Այս պահին ընկերներից մի քանիսը կասեն, հետո ես կչափեմ կոնցենտրացիան մաքրումից հետո;Այստեղ Foregene-ը ցանկանում է հիշեցնել, որ cDNA-ն խորհուրդ չի տրվում մաքրել, քանի որ հակադարձմամբ ստացված cDNA-ի երկարությունը տարբեր է, և կարճ cDNA-ն կկորչի մաքրման ընթացքում:
(2) Այսպիսով, ինչ անել:Մինչ qPCR փորձը, cDNA-ի նոսրացման գրադիենտը կարող է որոշվել նախնական փորձի միջոցով:Օրինակ՝ օգտագործեք cDNA պահեստային լուծույթ, 10 անգամ նոսրացում և 100 անգամ նոսրացում որպես qPCR փորձերի ձևանմուշներ և ընտրեք նոսրացման գործակիցը CT արժեքով 18-28 միջակայքում:

Ինչպե՞ս պետք է miRNA-ները հակադարձ արտագրել:
miRNA-ն միաշղթա փոքր մոլեկուլային ՌՆԹ է, որի չափը մոտ 22 նտ է, որը չի ծածկում սպիտակուցը:Իր կարճ երկարության պատճառով սովորական qPCR մեթոդը դժվար է ուղղակիորեն քանակականացնել այն, ուստի հաճախ անհրաժեշտ է երկարացնել miRNA-ն;ՄիՌՆԹ-ի հակադարձ տառադարձման սովորաբար օգտագործվող մեթոդները ներառում են ցողունային հանգույցի մեթոդը և պոչամբարի մեթոդը:
Ցողունային հանգույցի մեթոդն է ընդլայնել miRNA-ն՝ ավելացնելով ցողունային հանգույցի պրայմերներ:Հայտնաբերման այս մեթոդն ունի ավելի բարձր զգայունություն և առանձնահատկություն, բայց հայտնաբերման թողունակությունը ցածր է:Մեկ հակադարձ արտագրումը կարող է հայտնաբերել միայն մեկ miRNA և ներքին հղում;պոչի ավելացման մեթոդը բաղկացած է երկուից: Այն ավարտվում է երկու ֆերմենտների համատեղ գործողությամբ, որոնք են PolyA պոլիմերազը և հակադարձ տրանսկրիպտազը:PolyA պոլիմերազը պատասխանատու է miRNA-ին PolyA պոչեր ավելացնելու համար՝ դրա երկարությունը մեծացնելու համար, իսկ հակադարձ տրանսկրիպտազը կատարում է հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեակցիա:Այս մեթոդն ունի հայտնաբերման բարձր թողունակություն և կարող է հայտնաբերել բազմաթիվ miRNA-ներ և ներքին հղումներ մեկ հակադարձ տառադարձման մեջ, սակայն զգայունությունն ու յուրահատկությունը ցածր են ցողունային հանգույցի մեթոդում: