Բոլորը խոսում են qRT-PCR փորձի սկզբունքի, այբբենարանի ձևավորման, արդյունքների մեկնաբանման և այլնի մասին, բայց ես կարծում եմ, որ ես պետք է ձեզ հետ կիսվեմ qRT-PCR-ի փորձարարական գործողությամբ:Դա փոքր է, բայց խոսքը արդյունքների մասին է:

Մինչ qRT-PCR անելը, մենք պետք է հստակ պատկերացում ունենանք մեր սեփական ՌՆԹ-ի և գործողության մեթոդների մասին:Ի վերջո, մեր ջանքերն ուղղված են արդյունքի հասնելուն, այլ ոչ թե պարզապես զբաղվելուն։Այսպիսով, qRT-PCR անելուց առաջ մենք պետք է որոշենք հետևյալ խնդիրները (որոնցից մի քանիսը կիրառելի են միայն SYBR-ի համար):

1 Վստա՞հ եք, որ ձեր ՌՆԹ-ն քայքայված չէ:

NanoDrop 2000-ը կարող է հայտնաբերել միայն ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան և մաքրությունը, բայց չի կարող հայտնաբերել ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը:

RNA (RNA Intesity Number) արժեքը կարող է արտացոլել ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը, որը հայտնաբերվում է Agilent 2100 Bioanalyzer համակարգի կողմից:

Նկ. RIN արժեքների սխեմատիկ դիագրամ ՌՆԹ-ի տարբեր նմուշների համար (էուկարիոտներ)

Այնուամենայնիվ, լաբորատորիաները հիմնականում չունեն Agilent 2100 Bioanalyzer:Այս դեպքում մենք կարող ենք հայտնաբերել ֆորմալդեհիդի գելի միջոցով, սակայն ՌՆԹ-ի ընդհանուր քանակի պահանջը մեծ է, ուստի ամենաարագ մեթոդը սովորական գելային էլեկտրոֆորեզի օգտագործումն է։Պահանջվում է լինել նուկլեազից զերծ միջավայրում, ուստի անհրաժեշտ է ողողել էլեկտրոֆորեզի բաքը, լուծույթի շիշը, գելային փակագիծը և սանրել DEPC ջրով:Ագարոզը նույնպես նուկլեազազուրկ է (քանի դեռ այն թարմ է բացված), և բեռնման բուֆերը պետք է հնարավորինս թարմ բացվի՝ 1,2% գելով:

Նկատի ունեցեք, որ գելը պետք է ամբողջությամբ լուծարվի, հակառակ դեպքում այն ​​կառաջացնի անհամասեռ շերտեր, ինչպես ցույց է տրված նկարի 9-րդ նմուշում:Եթե ​​լարումը չափազանց բարձր է կամ շատ երկար է աշխատում, ջերմություն կառաջացնի և կառաջացնի ՌՆԹ-ի դեգրադացիա, ուստի լարումը և ժամանակը պետք է ողջամտորեն վերահսկվեն:Ի լրումն, գելի գործարկումը կարող է նաև հետագայում որոշել, թե արդյոք նմուշում կա ԴՆԹ մնացորդ, և դիտարկել, թե արդյոք կա՞ն արդյոք մեծ թվով պահպանված ժապավեններ բաշխիչ հորում:

Նկար.ՌՆԹ-ի գել էլեկտրոֆորեզի հայտնաբերում

2 Վստա՞հ եք ձեր cDNA-ի կոնցենտրացիայի մասին:

Լաբորատորիայում մեծ եղբայրների փորձն այն է, որ յուրաքանչյուր ինվերսիայի արդյունքում ստացված 20 ul համակարգի cDNA-ն ուղղակիորեն նոսրացվում է 20X, մինչդեռ հետդոկտորական քույրերը նոսրացվում են 10X:Ես սովորաբար կախված եմ իրավիճակից։Քանի որ յուրաքանչյուր անձի կողմից նշված ՌՆԹ-ի որակը տարբեր է, հակադարձման մակարդակը նույնպես տարբեր է, և հակադարձման տեխնոլոգիան կարող է կայուն չլինել:

Այսպիսով, ամեն անգամ, երբ ես ստանում եմ հակադարձ cDNA-ն, ես նախ այն մոտ 3 անգամ կնոսրացնեմ, այնուհետև կօգտագործեմ տնային տնտեսության գենը RT-PCR-ն անելու համար, ցիկլերի թիվը ընդհանուր առմամբ 25 ցիկլ է՝ կոնկրետ կոնցենտրացիան որոշելու համար, այնուհետև որոշելու վերջնական նոսրացման գործոնը:

3 Վստա՞հ եք, որ ձեր այբբենարանները հեշտ են օգտագործել:

Այն կարող է անցնել qRT-PCR-ի հալման կորը, բայց դա դեռ գումար արժե:Մեծ գումար չունեցող լաբորատորիաների համար, երբ նրանք ստանում են շատ պրայմերներ, նրանք կարող են օգտագործել սովորական RT-PCR՝ տեսնելու, թե արդյոք դա մեկ ժապավեն է և բացահայտելու պրայմերների առանձնահատկությունները:Եթե ​​լաբորատորիան փողի պակաս չունի, ապա բոլոր այբբենարանների առանձնահատկությունը կարելի է մեկ անգամ հայտնաբերել հալման կորի միջոցով:

4 Համոզվա՞ծ եք, որ ձեր փորձնական պայմանները հարմար են:

SYBR-ը պետք է պաշտպանված լինի ուժեղ լույսից, այնպես որ SYBR ռեագենտ ավելացնելիս փորձեք անջատել վերևի լույսը, և այն ավարտելու համար հարկավոր է օգտագործել միայն թույլ լույս:

Պահել SYBR-ը 4°C ջերմաստիճանում:Օգտագործման ժամանակ նրբորեն շրջեք վերև և վար, որպեսզի լավ խառնվի, որպեսզի չփրփրվի և ուժեղ պտտվեք:

Որոշ կրտսեր քույրեր սիրում են հետքեր նկարել PCR տախտակի վրա՝ վախենալով խառնել նմուշները, ինչը սխալ է:Քանի որ ձեր մարկերները շատ հավանական է, որ ազդեն լյումինեսցենտային ազդանշանների հավաքագրման վրա, ես սովորաբար կրտսերներին խորհուրդ եմ տալիս օգտագործել փորձնական նոթատետրեր՝ օգնելու հիշողությանը, ինչպես ցույց է տրված ստորև:

Նկար.qRT-PCR նմուշի բեռնման դիագրամ

5 Համոզվա՞ծ եք, որ դա ճիշտ եք անում:

Անպայման կրեք ձեռնոցներ, հագեք ձեռնոցներ, հագեք ձեռնոցներ և երեք անգամ ասեք կարևոր բաներ:

SYBR-ի լույսի ազդեցությունը նվազեցնելու համար ես անձամբ սիրում եմ նախ ձևանմուշ ավելացնել, ինչպես ցույց է տրված ստորև նկարում:Ըստ փորձի, փոքր քանակությամբ կաղապարի ավելացումը, հավանաբար, կառաջացնի նմուշառման սխալներ:Հետևաբար, փոքր քանակությամբ ձևանմուշ ավելացնելու հետևանքով առաջացած սխալը նվազագույնի հասցնելու համար ես սովորաբար կրկնապատկում եմ նմուշը և կրկնապատկում նմուշը ավելացնելիս՝ նվազեցնելու ավելացված H2O2-ի քանակը:

Նկար.qRT-PCR բեռնման սխեմատիկ դիագրամ

Այնուհետև կարգավորեք qRT-PCR համակարգը հետևյալ կերպ.

Նկար.qRT-PCR համակարգի պատրաստման դիագրամ

ԾԱՆՈԹՈՒԹՅՈՒՆ. Կազմաձևման գործընթացը պետք է կատարվի սառույցի վրա:

Նմուշը ավելացնելուց հետո կպցրեք թափանցիկ կնքման թաղանթը:Փորձեք ձեռքերով չդիպչել թափանցիկ կնքող թաղանթի մակերեսին, պարզապես գործեք թաղանթի երկու կողմերի տարածությունից:Քանի որ մատնահետքերը կարող են ազդել նաև լյումինեսցենտային ազդանշանների հավաքման վրա:Այնուհետև օգտագործեք ցենտրիֆուգ՝ ցածր արագությամբ 10 վայրկյան արագ ցենտրիֆուգելու համար, որպեսզի նմուշը չկախվի պատից:

Առնչվող ապրանքներ.

Cell Direct RT-qPCR հավաքածու

RT Easy II