Հայտնաբերման առանձնահատկությունը

Շատ դեպքերում այբբենարանի ձևավորման նպատակը PCR-ի առանձնահատկությունն առավելագույնի հասցնելն է:Սա որոշվում է շատ փոփոխականների քիչ թե շատ կանխատեսելի ազդեցությամբ:Կարևոր փոփոխականներից մեկն այն հաջորդականությունն է այբբենարանի 3′ վերջում:

Կարևորն այն է, որ PCR վերլուծությունները, որոնք նախատեսված են յուրահատկության համար, ավելի հավանական է, որ պահպանեն բարձր արդյունավետությունը լայն դինամիկ տիրույթում, քանի որ վերլուծությունը չի արտադրում ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման արտադրանք, դրանով իսկ մրցելով PCR ռեակտիվների հետ կամ արգելակելով հիմնական ուժեղացման ռեակցիան:

Իհարկե, որոշ դեպքերում առանձնահատուկությունն ամենակարևորը չէ, օրինակ, երբ նպատակը սերտորեն կապված, բայց տարբեր պաթոգենների քանակականացումն է, պահանջվում են հատուկ նախագծման, օպտիմալացման և ստուգման ստանդարտներ:

Հալման կորը ստանդարտ մեթոդ է ամպլիկոնների առանձնահատկությունը գնահատելու համար, գոնե մեկ թիրախի ուժեղացման առումով:Այնուամենայնիվ, պետք է ընդգծել, որ հալման կորերը կարող են ապակողմնորոշիչ լինել, քանի որ, օրինակ, դրանց վրա կարող են ազդել ոչ օպտիմալ այբբենարանների և կաղապարի ցածր կոնցենտրացիաների համակցված ազդեցությունները:

P5 |Հալման կորը ցույց է տալիս Tm տեղաշարժերը, որոնք ստացվում են երկու թիրախային ԴՆԹ-ների տարբեր քանակությունների երկու հայտնաբերումից:

A. Ավելի բարձր կոնցենտրացիաների դեպքում (ad)), qPCR-ի չափումն ավարտվելուց հետո ակնհայտ այբբենարանի դիմեր չկա:Քանի որ կաղապարի կոնցենտրացիան նվազում է մինչև 50 օրինակ (e), ոչ սպեցիֆիկ արտադրանքը սկսում է հայտնվել և դառնում է միակ արտադրանքը ամենացածր կոնցենտրացիայի դեպքում (f):

B. Փորձարկումը գրանցեց նույն Tms-ը բոլոր թիրախային կոնցենտրացիաներում, և չկար ակնհայտ այբբենարանի դիմեր նույնիսկ ամենացածր կոնցենտրացիայի դեպքում (5 օրինակ):Այս երկու հայտնաբերման մեթոդներն օգտագործելիս NTC-ներում ուժեղացման արտադրանքներ չեն հայտնաբերվել:

P5-ը ցույց է տալիս տարրալուծման կորերը, որոնք ստացվել են նմուշներով, որոնցում կաղապարը առկա է տարբեր կոնցենտրացիաներում:P 5a-ն ցույց է տալիս, որ երկու ամենացածր կոնցենտրացիաների դեպքում արտադրված ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման արտադրանքի Tms-ն ավելի ցածր է, քան հատուկ ամպլիկոններինը:

Ակնհայտ է, որ հայտնաբերման այս մեթոդը չի կարող հուսալիորեն օգտագործվել ցածր կոնցենտրացիաներում առկա թիրախները հայտնաբերելու համար:

Հետաքրքիր է, որ NTC-ները, այսինքն՝ ընդհանրապես ԴՆԹ չունեցող նմուշները չեն գրանցել (ոչ սպեցիֆիկ) ամպլիֆիկացման արտադրանք, ինչը ցույց է տալիս, որ ֆոնային գենոմային ԴՆԹ-ն կարող է մասնակցել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման/պոլիմերացմանը:

Երբեմն նման ֆոնային պրայմերները և ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը չեն կարող շտկվել, բայց հաճախ հնարավոր է նախագծել հայտնաբերման մեթոդ, որը չունի ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում որևէ ձևանմուշի կոնցենտրացիայի և NTC-ում (P 5b):

Այստեղ, նույնիսկ գրանցելով թիրախային կոնցենտրացիայի ուժեղացումը Cq 35-ով, կստեղծվի տարրալուծման հատուկ կոր:Նմանապես, NTC-ները ցույց չեն տվել ոչ հատուկ ուժեղացման նշաններ:Երբեմն հայտնաբերման վարքագիծը կարող է կախված լինել մայրական լիկյորից, և որոշ բուֆերային կոմպոզիցիաներում հայտնաբերվում է միայն ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում, որը կարող է կապված լինել տարբեր Mg2+ կոնցենտրացիաների հետ:

Հայտնաբերման կայունություն

Ta-ի օպտիմալացումը օգտակար քայլ է qPCR հայտնաբերման էմպիրիկ ստուգման և օպտիմալացման գործընթացում:Այն ուղղակիորեն ցույց է տալիս այբբենարանի ամրությունը՝ ցույց տալով ջերմաստիճանը (կամ ջերմաստիճանի միջակայքը), որն արտադրում է ամենացածր Cq առանց NTC-ի ուժեղացման:

Զգայունության երկու-չորս անգամ տարբերությունը չի կարող կարևոր լինել mRNA-ի բարձր արտահայտվածություն ունեցող մարդկանց համար, բայց ախտորոշիչ թեստերի համար դա կարող է նշանակել դրական և կեղծ բացասական արդյունքների տարբերություն:

qPCR պրայմերների Ta հատկությունները կարող են շատ տարբեր լինել:Որոշ փորձարկումներ այնքան էլ կայուն չեն, և եթե դրանք չկատարվեն այբբենարանների օպտիմալ Ta արժեքի ներքո, դրանք արագ կփլուզվեն:

Սա կարևոր է, քանի որ հայտնաբերման այս տեսակը հաճախ խնդրահարույց է իրական աշխարհում, և նմուշի մաքրությունը, ԴՆԹ-ի կոնցենտրացիան կամ այլ ԴՆԹ-ի առկայությունը կարող են օպտիմալ չլինել:

Բացի այդ, նպատակային պատճենի համարը կարող է տարբեր լինել լայն շրջանակում, և ռեակտիվները, պլաստիկ պարագաները կամ գործիքները կարող են տարբերվել թեստը կարգավորելիս օգտագործվողներից:

P6|Ջերմաստիճանի գրադիենտը ցույց է տալիս PCR հայտնաբերման տարբեր ամրությունը:

A. Օգտագործեք Bioline's Sensifast SYBR mastermix-ը (կատալոգի համարը BIO-98050)՝ մարդու ուղեղի ՌՆԹ-ից պատրաստված cDNA-ի վրա PCR-ն իրականացնելու համար:

B. Օգտագործեք Bio-Rad-ի CFX qPCR գործիքը՝ ապալենի ուժեղացման քարտեզը և տարրալուծման կորը գրանցելու համար (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG):

C. ACSBG1-ի ուժեղացման գրաֆիկ և հալման կոր (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG):

D. GFAP-ի ուժեղացման գրաֆիկ և տարրալուծման կոր (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCTCTCGTGGATCTTC):

E. Cq-ները գրանցված են եռացման տարբեր ջերմաստիճաններում՝ ցույց տալով Cq-ի տարբերությունը, որը գրանցված է 7C ջերմաստիճանի գրադիենտի ներքո:

P 6-ը ցույց է տալիս անցանկալի թեստի տիպիկ արդյունք, որտեղ qPCR-ն իրականացվել է 59C-ից մինչև 67C ջերմաստիճանի (P 6a) գրադիենտ Tas-ի միջոցով՝ օգտագործելով պրայմերներ մարդու ուղեղին հատուկ երեք գեների համար:

Ուժեղացման գրաֆիկից երևում է, որ Opalin պրայմերները հեռու են իդեալական լինելուց, քանի որ դրանց օպտիմալ Ta միջակայքը շատ նեղ է (Նկար 6b), այսինքն՝ Cq-ները լայնորեն ցրված են, ինչի հետևանքով Cq-ները զգալիորեն համեմատվում են իրենց օպտիմալ Cqs ցածրի հետ:

Հայտնաբերման այս մեթոդը անկայուն է և կարող է հանգեցնել ոչ օպտիմալ ուժեղացման:Հետեւաբար, այս զույգ այբբենարանները պետք է վերանախագծվեն:Բացի այդ, հալման կորի վերլուծությունը (ներդիր) ցույց է տալիս, որ հայտնաբերման այս մեթոդի առանձնահատկությունը նույնպես կարող է խնդրահարույց լինել, քանի որ յուրաքանչյուր Ta-ի հալման կորը տարբեր է:

P 6c-ում ցուցադրված ACSBG1-ի հայտնաբերման մեթոդն ավելի ամուր է, քան վերը նշված Opalin-ի հայտնաբերման մեթոդը, բայց այն դեռ հեռու է իդեալական լինելուց, և հավանական է, որ այն կարող է բարելավվել:

Այնուամենայնիվ, մենք ընդգծում ենք, որ անհրաժեշտ կապ չկա ամրության և յուրահատկության միջև, քանի որ հայտնաբերման այս մեթոդով ստեղծված տարրալուծման կորը ցույց է տալիս նույն առավելագույն արժեքը բոլոր Tas-ում (ներդիր):

Մյուս կողմից, ամրության թեստը շատ ավելի հանդուրժող է, արտադրելով նմանատիպ Cq-ներ Tas-ի լայն տեսականիում, ինչպես P 6d-ում ցուցադրված GFAP թեստում:

Նույն 8 աստիճան Ցելսիուսի միջակայքում ստացված Cq-ների տարբերությունը 1-ից պակաս է, և տարրալուծման կորը (ներդիրը) հաստատում է հայտնաբերման բնութագրերը այս ջերմաստիճանի միջակայքում:Հարկ է նշել, որ հաշվարկված Tas-ը և Tas-ի իրական միջակայքը կարող են շատ տարբեր լինել:

Կան բազմաթիվ ուղեցույցներ, որոնք նախագծված են օգնելու հետազոտողներին արդյունավետ այբբենարաններ մշակել, որոնց մեծ մասը հիմնված է վաղուց հաստատված կանոնների վրա և մեծ ուշադրություն է դարձվել այբբենարանների 3-ին:Հաճախ խորհուրդ է տրվում ներառել G կամ C 3' վերջում և երկու G կամ C հիմքեր (GC սեղմակ), բայց ոչ ավելի, քան վերջին 5 հիմքերից երկուսը:

Գործնականում այս կանոնները կարող են ուղղորդել հետազոտողներին, բայց դրանք պարտադիր չէ, որ ճիշտ լինեն բոլոր հանգամանքներում:

P7 |Այբբենարանի 3-րդ վերջը քիչ ազդեցություն ունի յուրահատկության կամ արդյունավետության վրա:

Ա. Մարդու HIF-1α (NM_181054.2) գենի պրայմերների դիրքը:

B. Օգտագործեք Agilent Brilliant III SYBR Կանաչ մայրական լիկյոր (Cat. No. 600882) վեց փորձնական տարրեր ուժեղացնելու համար:

Գ. Ուժեղացման գրաֆիկ և հալման կորը գրանցված Bio-Rad's CFX qPCR գործիքով և 3' վերջի պրայմերներով:NTC-ները ցուցադրվում են կարմիրով:

D. Cqs գրանցում յուրաքանչյուր փորձարկման կետի համար

Օրինակ, P 7-ի արդյունքը հակասում է 3' end կանոնին:Բոլոր նմուշները հիմնականում տալիս են նույն արդյունքները, ընդ որում միայն երկու այբբենարանի համակցությունները հանգեցնում են NTC-ում ոչ հատուկ ուժեղացման:

Այնուամենայնիվ, մենք չենք կարող աջակցել GC հոլովակի էֆեկտին, քանի որ այս դեպքում A կամ T-ն առավելագույնը 30 հիմք օգտագործելը չի ​​նվազեցնում սպեցիֆիկությունը:

C թեստը, որտեղ F այբբենարանը ավարտվում է GGCC-ով, գրանցեց Cq-ները NTC-ներում՝ ցույց տալով, որ կարելի է խուսափել այս հաջորդականություններից 30-րդ վերջում:Մենք ընդգծում ենք, որ այբբենարանի զույգի լավագույն 3' վերջի հաջորդականությունը որոշելու միակ միջոցը որոշ թեկնածու այբբենարանների փորձնական գնահատումն է:

Ուժեղացման արդյունավետություն

Կարևոր է, թեև ոչ սպեցիֆիկ PCR հայտնաբերումը երբեք չի կարող սպեցիֆիկ դառնալ, ուժեղացման արդյունավետությունը կարող է ճշգրտվել և առավելագույնի հասցնել տարբեր ձևերով՝ փոխելով ֆերմենտը, մայրական լիկյորը, հավելումները և ցիկլային պայմանները:

PCR-ի հայտնաբերման արդյունավետությունը գնահատելու համար լավագույնն է օգտագործել թիրախային նուկլեինաթթվի 10 կամ 5 անգամ սերիական նոսրացում, այսինքն՝ «ստանդարտ կորի մեթոդ»:

Եթե ​​PCR ամպլիկոնները կամ սինթետիկ ԴՆԹ թիրախները օգտագործվում են ստանդարտ կորի ստեղծման համար, ապա այդ թիրախների սերիական նոսրացումները պետք է խառնվեն ֆոնային ԴՆԹ-ի մշտական ​​քանակի հետ (օրինակ՝ գենոմային ԴՆԹ):

P8 |Նոսրացման կորը PCR-ի արդյունավետությունը գնահատելու համար:

A. Օգտագործեք պրայմերներ HIF-1-ի համար. F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA և R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC և Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (կատալոգի համարը 600882) PCR-ի և հալման կորի պայմանների համար:

B. 100 նգ ՌՆԹ-ն հակադարձ արտագրվել է, նոսրացվել 2 անգամ, և սերիական նոսրացված cDNA նմուշները նոսրացվել են 5 անգամ մինչև 1 նգ մարդու գենոմային ԴՆԹ:Հալման կորը ցուցադրված է ներդիրում:

C. RT ռեակցիան, նոսրացումը և սերիական նոսրացումը կրկնվեցին cDNA-ի երկրորդ նմուշի համար, և արդյունքները նման էին:

P 8-ը ցույց է տալիս երկու ստանդարտ կորեր՝ օգտագործելով նույն հայտնաբերման մեթոդը երկու տարբեր cDNA նմուշների վրա, արդյունքը նույն արդյունավետությունն է՝ մոտ 100%, և R2 արժեքը նույնպես նման է, այսինքն՝ համապատասխանության աստիճանը փորձարարական տվյալների և ռեգրեսիոն գծի կամ տվյալների գծայինության աստիճանի միջև:

Երկու ստանդարտ կորերը համեմատելի են, բայց ոչ բոլորովին նույնը:Եթե ​​նպատակը թիրախի ճշգրիտ քանակականացումն է, ապա պետք է նշել, որ անընդունելի է պատճենի համարի հաշվարկ տրամադրել՝ առանց բացատրելու անորոշությունը:

P9 |Չափման անորոշություն՝ կապված ստանդարտ կորի օգտագործմամբ քանակականացման հետ.

A. Օգտագործեք պրայմերներ GAPDH-ի համար (NM_002046) PCR և հալման կորի պայմանները կատարելու համար:F. ACAGTTGCCATGTAGACC և R. TAACTGGTTGAGCACAGG և Bioline's Sensifast SYBR mastermix (կատալոգի համարը BIO-98050):

Բ. Ուժեղացման աղյուսակ, հալման կոր և ստանդարտ կոր, որը գրանցված է Bio-Rad-ի CFX qPCR գործիքով:

Գ. Ստանդարտ կորի գրաֆիկ և 95% վստահության միջակայք (CI):

Դ. Նոսրացման կորից ստացված երեք Cq արժեքների պատճենների թիվը և 95% վստահության միջակայքը:

P 9-ը ցույց է տալիս, որ օպտիմիզացված թեստի համար մեկ ստանդարտ կորի բնորոշ փոփոխականությունը մոտավորապես 2 անգամ է (95% վստահության միջակայք, նվազագույնից առավելագույնը), որը կարող է լինել ամենափոքր փոփոխականությունը, որը կարելի է սպասել:

Առնչվող ապրանք.

Cell Direct RT qPCR հավաքածու

Mouse Tail Direct PCR հավաքածու

Animal Tissue Direct PCR հավաքածու