Cell Direct RT qPCR հավաքածու — SYBR GREEN I Direct Cell Lysis Cell Ready մի քայլ qRT-PCR հավաքածուներ
Նկարագրություններ
Այս հավաքածուն օգտագործում է լիզի բուֆերային եզակի համակարգ, որը կարող է արագորեն արձակել ՌՆԹ մշակված բջիջների նմուշներից RT-qPCR ռեակցիաների համար՝ դրանով իսկ վերացնելով ՌՆԹ-ի մաքրման ժամանակատար և աշխատատար գործընթացը:ՌՆԹ կաղապարը կարելի է ձեռք բերել ընդամենը 7 րոպեում։5-ը×Direct RT Mix և 2×Ուղղակի qPCR Mix-SYBR ռեակտիվները, որոնք տրամադրվում են հավաքածուի կողմից, կարող են արագ և արդյունավետ կերպով ստանալ իրական ժամանակի քանակական PCR արդյունքները:
5×Direct RT Mix և 2×Direct qPCR Mix-SYBR-ն ունի ուժեղ արգելակիչ հանդուրժողականություն, և նմուշների լիզատը կարող է ուղղակիորեն օգտագործվել որպես ձևանմուշ RT-qPCR-ի համար:Այս փաթեթը պարունակում է եզակի ՌՆԹ բարձր հարաբերակցությամբ Foregene հակադարձ տրանսկրիպտազ և Hot D-Taq ԴՆԹ պոլիմերազ, dNTPs, MgCl:2, ռեակցիայի բուֆեր, PCR օպտիմիզատոր և կայունացուցիչ:
Տեխնիկական պայմաններ
200 թ×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Հավաքածուի բաղադրիչներ
| Մաս I | Բուֆեր CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Բուֆեր ST | |
| Մաս II | ԴՆԹ ռետին |
| 5× Direct RT Mix | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | |
| 50× ROX Reference ներկ | |
| ՌՆազազերծ ddH2O | |
| Հրահանգներ | |
Առանձնահատկություններ և առավելություններ
■Պարզ և արդյունավետ. Cell Direct RT տեխնոլոգիայով ՌՆԹ-ի նմուշները կարելի է ստանալ ընդամենը 7 րոպեում:
■ Նմուշի պահանջարկը փոքր է, մինչև 10 բջիջ կարող է փորձարկվել:
■ Բարձր թողունակություն. այն կարող է արագ հայտնաբերել ՌՆԹ-ն 384, 96, 24, 12, 6 հորատանցքերի թիթեղներում մշակված բջիջներում:
■ ԴՆԹ ռետինը կարող է արագ հեռացնել ազատված գենոմները՝ զգալիորեն նվազեցնելով ազդեցությունը հետագա փորձարարական արդյունքների վրա:
■ Օպտիմիզացված RT և qPCR համակարգը դարձնում է երկքայլ RT-PCR հակադարձ տրանսկրիպցիան ավելի արդյունավետ, իսկ PCR-ն ավելի կոնկրետ և ավելի դիմացկուն RT-qPCR ռեակցիայի ինհիբիտորների նկատմամբ:
Կոմպլեկտի հավելված
Կիրառման շրջանակը՝ կուլտիվացված բջիջներ:
- Նմուշի լուծմամբ արձակված ՌՆԹ. կիրառելի է միայն այս փաթեթի RT-qPCR ձևանմուշի համար:
- Կոմպլեկտը կարող է օգտագործվել հետևյալ նպատակների համար՝ գենային էքսպրեսիայի վերլուծություն, siRNA միջնորդավորված գենի խլացման էֆեկտի ստուգում, դեղերի սքրինինգ և այլն։
Դիագրամ
Պահպանում և պահպանման ժամկետ
Այս փաթեթի I մասը պետք է պահվի 4℃ ջերմաստիճանում;Երկրորդ մասը պետք է պահվի -20℃ ջերմաստիճանում:
Foregene Protease Plus II-ը պետք է պահվի 4-ում℃, մի սառչեք -20℃ ջերմաստիճանում:
Ռեակտիվ 2×Direct qPCR Mix-SYBR-ը պետք է պահվի -20-ում℃մթության մեջ;հաճախակի օգտագործման դեպքում այն կարող է պահվել նաև 4-ում℃ կարճաժամկետ պահպանման համար (օգտագործել 10 օրվա ընթացքում):
Իրական ժամանակում PCR պրայմերների նախագծման սկզբունքները
Forward Primer և Reverse Primer
Իրական ժամանակում PCR-ի համար այբբենարանի ձևավորումը շատ կարևոր է:Պրայմերները կապված են PCR ուժեղացման առանձնահատկությունների և արդյունավետության հետ և կարող են նախագծվել հետևյալ սկզբունքներով.
Այբբենարանի երկարությունը՝ 18-30bp:
GC պարունակությունը՝ 40-60%:
Tm արժեքը. Primer նախագծման ծրագրակազմը, ինչպիսին է Primer 5-ը, կարող է տալ այբբենարանի Tm արժեքը:Վերև և ներքև գտնվող այբբենարանների Tm արժեքները պետք է հնարավորինս մոտ լինեն:Կարող է օգտագործվել նաև Tm հաշվարկման բանաձևը՝ Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T):PCR-ն իրականացնելիս որպես եռացման ջերմաստիճան սովորաբար ընտրվում է պրայմերային Tm արժեքից ցածր 5 °C ջերմաստիճան (եռացման ջերմաստիճանի համապատասխան աճը կարող է մեծացնել PCR ռեակցիայի առանձնահատկությունը):
Պրայմերներ և PCR արտադրանք.
Դիզայնի այբբենարան PCR ուժեղացման արտադրանքի երկարությունը նախընտրելի է 100-150 bp:
Կաղապարի երկրորդական կառուցվածքային տարածքում նախագծային այբբենարանները պետք է հնարավորինս խուսափել:
Խուսափեք 2 կամ ավելի փոխլրացնող հիմքերի ձևավորումից վերև և ներքև գտնվող այբբենարանների 3' ծայրերի միջև:
Primer 3′ տերմինալային հիմքը չի կարող առկա լինել 3 լրացուցիչ հաջորդական G կամ C-ով:
Պրայմերներն իրենք չեն կարող ունենալ լրացուցիչ կառուցվածքներ, հակառակ դեպքում կձևավորվի մազակալի կառուցվածք, որը կազդի PCR ուժեղացման վրա:
ATCG-ն պետք է հնարավորինս հավասարաչափ բաշխվի այբբենարանի հաջորդականությամբ, և 3' տերմինալային հիմքը պետք է խուսափել, քանի որ T.
Հավելված 1:Cell Direct RT-qPCR Kit բաղադրիչի հավելումների փաթեթ
1.Բջջային լիզի լուծույթ
|
| |||
| Հավաքածուի բաղադրիչներ (24-հորատանցքերի լիզի համակարգ / ջրհոր) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 Տ | 500 Տ | ||
| մասԻ | Բուֆեր CL | 20 մլ | 100 մլ |
| Foregene Protease Plus II | 400 մլ | 1 մլ × 2 | |
| Բուֆեր ST | 1 մլ × 2 | 10 մլ | |
| մասII | ԴՆԹ ռետին | 400 մլ | 1 մլ × 2 |
2.RT Միքս
|
| |
| Հավաքածուի բաղադրիչներ (20 մկլ ռեակցիայի համակարգ) | DRT-01011-B1 |
| 200 Տ | |
| 5× Direct RT Mix | 800 մլ |
| ՌՆազազերծ ddH2O | 1,7 մլ × 2 |
|
| ||
| Հավաքածուի բաղադրիչներ (20 մկլ ռեակցիայի համակարգ) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 Տ | 1000 Տ | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | 1 մլ × 2 | 1,7 մլ × 6 |
| 50× ROX Reference ներկ | 40 մլ | 200 մլ |
| ՌՆազազերծ ddH2O | 1,7 մլ | 10 մլ |
Հրահանգների ձեռնարկներ.
