Այբբենարանի նախագծման հիմքը (99% խնդիրներ կարող են լուծվել)

1. Այբբենարանի երկարությունը. Դասագրքի համար պահանջվում է 15-30 bp, սովորաբար մոտ 20 bp:Իրական պայմանը ավելի լավ է լինի 18-24 bp՝ սպեցիֆիկությունը ապահովելու համար, բայց որքան երկար, այնքան լավ, չափազանց երկար այբբենարանը նույնպես կնվազեցնի սպեցիֆիկությունը և կնվազեցնի եկամտաբերությունը:

2. Այբբենարանի ուժեղացման միջակայքը. 200-500bp տեղին է, և հատվածը կարող է ընդլայնվել մինչև 10kb հատուկ պայմաններում:

3. Այբբենարանի հիմք. G+C-ի պարունակությունը պետք է լինի 40-60%, շատ քիչ G+C ուժեղացման էֆեկտը լավ չէ, շատ G+C-ն հեշտ է երևալ ոչ սպեցիֆիկ շերտեր:ATGC-ն լավագույնս բաշխվում է պատահականորեն՝ խուսափելով ավելի քան 5 պուրինային կամ պիրիմիդին նուկլեոտիդներից բաղկացած կլաստերներից:Multi-gc 5′ վերջի և միջանկյալ հաջորդականությունների համար՝ կայունությունը բարձրացնելու համար, խուսափեք հարուստ GC-ից 3′ վերջում, առանց GC-ի վերջին 3 հիմքերի համար կամ առանց GC-ի վերջին 5 հիմքերից 3-ի համար:

4. Խուսափեք պրայմերների երկրորդական կառուցվածքից և խուսափեք երկու այբբենարանների միջև լրացումից, հատկապես 3' վերջում լրացումից, հակառակ դեպքում կձևավորվի այբբենարանի դիմեր և կստեղծվեն ոչ հատուկ ուժեղացված շերտեր:

5. Պրայմերների 3 'վերջում գտնվող հիմքերը, հատկապես վերջին և նախավերջին հիմքերը, պետք է խստորեն զուգակցվեն՝ չզուգակցված տերմինալային հիմքերի պատճառով ՊՇՌ ձախողումից խուսափելու համար:

6. Պրայմերները ունեն կամ կարող են ավելացվել համապատասխան ճեղքման վայրերով, և ուժեղացված թիրախային հաջորդականությունը նախընտրելի է ունենալ համապատասխան ճեղքման վայրեր, ինչը շատ օգտակար է ճեղքման վերլուծության կամ մոլեկուլային կլոնավորման համար:

7. Պրայմերների առանձնահատկությունները. պրայմերները չպետք է ունենան ակնհայտ հոմոոլոգիա նուկլեինաթթուների հաջորդականության տվյալների բազայի այլ հաջորդականությունների հետ:

8. Սովորեք օգտագործել ծրագրեր՝ PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Այս առցանց դիզայնը լավագույնս աշխատում է):

Վերոնշյալ բովանդակությունը կարող է լուծել այբբենարանի նախագծման խնդիրների առնվազն 99%-ը:

Վերահսկեք այբբենարանի ձևավորման մանրամասները

1. Այբբենարանի երկարությունը

Ընդհանուր այբբենարանի երկարությունը 18-30 հիմք է:Ընդհանուր առմամբ, այբբենարանի եռացման ջերմաստիճանը որոշող ամենակարեւոր գործոնը այբբենարանի երկարությունն է:Հիմնականում ընտրվում է այբբենարանի եռացման ջերմաստիճանը (Tm արժեքը -5℃), իսկ ոմանք ուղղակիորեն օգտագործում են Tm արժեքը:Հետևյալ բանաձևերը կարող են օգտագործվել այբբենարանների եռացման ջերմաստիճանը մոտավորապես հաշվարկելու համար.

Երբ այբբենարանի երկարությունը 20 bp-ից պակաս է՝ [4(G+C)+2(A+T)]-5℃

Երբ այբբենարանի երկարությունը 20 bp-ից մեծ է՝ 62,3℃+0,41℃(%GC)-500/երկարություն-5℃

Բացի այդ, շատ ծրագրեր կարող են օգտագործվել նաև եռացման ջերմաստիճանը հաշվարկելու համար, հաշվարկի սկզբունքը տարբեր կլինի, ուստի երբեմն հաշվարկված արժեքը կարող է ունենալ փոքր բաց:PCR ռեակցիաները օպտիմալացնելու համար ամենակարճ պրայմերները, որոնք ապահովում են 54℃-ից ոչ պակաս եռացման ջերմաստիճանը, օգտագործվում են լավագույն արդյունավետության և յուրահատկության համար:

Ընդհանուր առմամբ, այբբենարանի առանձնահատկությունն ավելանում է չորս գործակցով յուրաքանչյուր լրացուցիչ նուկլեոտիդի համար, այնպես որ պրիմերի նվազագույն երկարությունը շատ կիրառությունների համար 18 նուկլեոտիդ է:Պրայմերների երկարության վերին սահմանը շատ կարևոր չէ, հիմնականում կապված է ռեակցիայի արդյունավետության հետ:Էնտրոպիայի պատճառով, որքան երկար է այբբենարանը, այնքան ցածր է այն արագությունը, որով այն կպչում է թիրախ ԴՆԹ-ին, որպեսզի ձևավորի կայուն երկշղթա ձևանմուշ ԴՆԹ պոլիմերազի միացման համար:

Պրայմերների նախագծման համար ծրագրակազմ օգտագործելիս պրայմերների երկարությունը կարող է որոշվել TM արժեքով, հատկապես ֆլուորեսցենտային քանակական PCR-ի պրայմերների համար, TM=60℃ կամ ավելին պետք է վերահսկվի:

2.GC բովանդակությունը

Ընդհանուր առմամբ, G+C-ի պարունակությունը այբբենարանների հաջորդականություններում կազմում է 40%~60%, և GC-ի պարունակությունը և Tm արժեքը զույգ այբբենարաններում պետք է համաձայնեցված լինեն:Եթե ​​այբբենարանը լուրջ GC կամ AT միտում ունի, ապա համապատասխան քանակությամբ A, T կամ G և C պոչը կարող է ավելացվել այբբենարանի 5 'վերջին:

3. Հալման ջերմաստիճանը

Եռացման ջերմաստիճանը պետք է լինի 5℃ ցածր, քան շղթայազերծման ջերմաստիճանը:Եթե ​​պրայմերային հիմքերի թիվը փոքր է, ապա եռացման ջերմաստիճանը կարող է համապատասխան կերպով բարձրացնել, ինչը կարող է մեծացնել PCR-ի առանձնահատկությունը:Եթե ​​հիմքերի թիվը մեծ է, ապա եռացման ջերմաստիճանը կարող է համապատասխանաբար կրճատվել:4℃ ~ 6℃ զույգ այբբենարանների եռացման ջերմաստիճանի տարբերությունը չի ազդի PCR-ի արդյունքի վրա, բայց իդեալականորեն զույգ այբբենարանների եռացման ջերմաստիճանը նույնն է, որը կարող է տատանվել 55℃ ~ 75℃:

4. Խուսափեք ուժեղացման կաղապարի երկրորդական կառուցվածքի տարածքից

Ավելի լավ է խուսափել կաղապարի երկրորդական կառուցվածքի շրջանից ուժեղացված բեկորն ընտրելիս:Թիրախային հատվածի կայուն երկրորդական կառուցվածքը կարելի է կանխատեսել և գնահատել համապատասխան համակարգչային ծրագրային ապահովման միջոցով, որն օգտակար է ձևանմուշների ընտրության համար:Փորձարարական արդյունքները ցույց են տալիս, որ ընդլայնումը հաճախ անհաջող է լինում, երբ ընդլայնվող տարածաշրջանի ազատ էներգիան (△G) պակաս է 58,6 կՋ/մոլից:

5. Թիրախային ԴՆԹ-ի հետ անհամապատասխանություն

Երբ ուժեղացված թիրախային ԴՆԹ-ի հաջորդականությունը մեծ է, այբբենարանը կարող է կապվել թիրախային ԴՆԹ-ի մի քանի մասերի հետ, ինչի արդյունքում արդյունքում հայտնվում են բազմաթիվ շերտեր:Այս անգամ անհրաժեշտ է օգտագործել BLAST ծրագրային ապահովման թեստավորում, կայքը.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Ընտրեք Հավասարեցնել երկու հաջորդականությունը (bl2seq):

Պրայմերների հաջորդականությունները 1-ին և թիրախային ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները 2-ին կպցնելը փոխարինելի է, և BLAST-ը հաշվարկում է փոխլրացնող, հակասական և այլ հնարավորություններ, այնպես որ օգտագործողները կարիք չունեն նկատել, թե երկու շղթաներն էլ զգայական շղթաներ են:Դուք կարող եք նաև մուտքագրել GI համարը, եթե գիտեք տվյալների բազայի հաջորդականության GI համարը, այնպես որ դուք ստիպված չեք լինի տեղադրել հաջորդականության մեծ հատված:Վերջապես, կտտացրեք «Հավասարեցնել 3-ին»՝ տեսնելու, թե արդյոք այբբենարանը թիրախ ԴՆԹ-ում ունի բազմաթիվ հոմոլոգ տեղամասեր:

6. Primer տերմինալ

Այբբենարանի 3-րդ վերջն այն է, որտեղ սկսվում է ընդլայնումը, ուստի կարևոր է կանխել անհամապատասխանությունները այնտեղից:3 'վերջը չպետք է լինի ավելի քան 3 անընդմեջ G կամ C, քանի որ դա կհանգեցնի այն բանի, որ այբբենարանը սխալմամբ գործարկվի G+C հարստացման հաջորդականության շրջանում:3' ծայրը չի կարող ձևավորել որևէ երկրորդական կառուցվածք, բացառությամբ հատուկ PCR (AS-PCR) ռեակցիաների, այբբենարանի 3' ծայրը չի կարող չհամընկնել:Օրինակ, եթե կոդավորման շրջանն ուժեղացված է, ապա այբբենարանի 3' վերջը չպետք է ավարտվի կոդոնի երրորդ դիրքում, քանի որ կոդոնի երրորդ դիրքը հակված է այլասերման, ինչը կազդի ուժեղացման առանձնահատկությունների և արդյունավետության վրա:Կցման պրայմերներ օգտագործելիս դիմեք կոդոնների օգտագործման աղյուսակին, ուշադրություն դարձրեք կենսաբանական նախապատվություններին, մի օգտագործեք կցման պրայմերներ 3′ վերջում և օգտագործեք պրայմերների ավելի բարձր կոնցենտրացիան (1uM-3uM):

7. Պրայմերների երկրորդական կառուցվածքը

Ինքնին այբբենարանները չպետք է ունենան փոխլրացնող հաջորդականություն, հակառակ դեպքում այբբենարաններն իրենք կծալվեն մազակալի կառուցվածքների մեջ, և այս երկրորդական կառուցվածքը կազդի այբբենարանների և կաղապարների կապակցման վրա՝ ստերիկ խանգարման պատճառով:Եթե ​​օգտագործվում է արհեստական ​​դատողություն, ապա ինքնին այբբենարանների շարունակական լրացուցիչ հիմքերը չպետք է լինեն 3 bp-ից ավելի:Երկու այբբենարանների միջև չպետք է լինի փոխլրացում, հատկապես պետք է խուսափել 3' ծայրի կոմպլեմենտար համընկնումը կանխելու համար այբբենարանի դիմերների ձևավորումը:Ընդհանուր առմամբ, զույգ այբբենարանների միջև չպետք է լինի ոչ ավելի, քան 4 անընդմեջ հիմքերի հոմոլոգիա կամ փոխլրացում:

8. Ավելացնել մարկերներ կամ տեղորոշիչներ

5 'վերջը քիչ ազդեցություն ունի ուժեղացման առանձնահատկությունների վրա և, հետևաբար, կարող է փոփոխվել՝ չազդելով ուժեղացման առանձնահատկությունների վրա:Պրայմեր 5-ի վերջի փոփոխությունը ներառում էր. ֆերմենտների սահմանափակման վայրի ավելացում;Նշված բիոտին, ֆլուորեսցենտ, դիգոքսին, Eu3+ և այլն: Ներդրեք սպիտակուցներին կապող ԴՆԹ-ի հաջորդականությունները;Մուտացիայի տեղամասերի ներմուծում, մուտացիաների հաջորդականությունների ներդրում և բացակայում և խթանող հաջորդականությունների ներմուծում և այլն: Լրացուցիչ հիմքերը քիչ թե շատ կազդեն ուժեղացման արդյունավետության վրա և կբարձրացնեն պրայմերային դիմերի ձևավորման հնարավորությունը, սակայն հաջորդ քայլի համար պետք է որոշ զիջումներ անել:Լրացուցիչ հաջորդականություններ, որոնք գոյություն չունեն թիրախային հաջորդականության վրա, ինչպիսիք են սահմանափակման վայրերը և խթանող հաջորդականությունները, կարող են ավելացվել այբբենարանի 5' ծայրին՝ առանց ազդելու յուրահատկության:Այս հաջորդականությունները ներառված չեն այբբենարանի Tm արժեքների հաշվարկում, սակայն պետք է փորձարկվեն փոխլրացման և ներքին երկրորդական կառուցվածքի համար:

9. Ենթակլոններ

Ժամանակի մեծ մասը PCR-ը միայն նախնական կլոնավորումն է, և այնուհետև մենք պետք է ենթակլոնավորենք թիրախային հատվածը տարբեր վեկտորների մեջ, այնպես որ մենք պետք է լրացուցիչ հիմքեր նախագծենք PCR-ի հաջորդ գործողության համար:

Սուբկլոնավորման համար նախատեսված որոշ հաջորդականություններ ամփոփված են ստորև:
Ավելացվել է սահմանափակումային էնդոնուկլեազի սահմանափակման տեղամաս

Ֆերմենտների սահմանափակման վայրերի ավելացումը PCR արտադրանքի ենթակլոնավորման ամենատարածված մեթոդն է:Ընդհանրապես, ճեղքման վայրը վեց հիմք է, բացի ճեղքման վայրի 5 'վերջից, անհրաժեշտ է ավելացնել 2 ~ 3 պաշտպանիչ հիմք:Այնուամենայնիվ, տարբեր ֆերմենտների կողմից պահանջվող պաշտպանիչ հիմքերի քանակը տարբեր է:Օրինակ, SalⅠ-ը չի պահանջում պաշտպանիչ հիմք, EcoRⅤ պահանջում է 1 պաշտպանիչ հիմք, NotⅠ պահանջում է 2 պաշտպանիչ հիմք, իսկ Hind Ⅲ պահանջում է 3 պաշտպանիչ հիմք:

LIC-ն ավելացնում է պոչը

LIC-ի ամբողջական անվանումն է Ligation-Independent cloning, կլոնավորման մեթոդ, որը հորինել է Navogen-ը հատուկ pET վեկտորի իր մասի համար:LIC մեթոդով պատրաստված pET կրիչն ունի ոչ կոմպլեմենտար 12-15 հիմք ունեցող միաշղթա կպչուն ծայրեր, որոնք լրացնում են թիրախային ներդիրի հատվածի համապատասխան կպչուն ծայրերը:Ուժեղացման նպատակով, ներդիր հատվածի այբբենարանի 5' հաջորդականությունը պետք է լրացնի LIC վեկտորը:T4 ԴՆԹ պոլիմերազի 3'→5' էքստրանեկտիվ ակտիվությունը կարճ ժամանակ անց կարող է ձևավորել մեկ շղթայական կպչուն ծայր ներդիր հատվածի վրա:Քանի որ արտադրանքը կարող է ձևավորվել միայն պատրաստված ներդիրի հատվածի և վեկտորի փոխադարձ կռումից, այս մեթոդը շատ արագ և արդյունավետ է, և այն ուղղված է կլոնավորմանը:
Ուղղորդված TA կլոն ավելացնել պոչը
TA կլոնավորումը չկարողացավ բեկորը թիրախավորել վեկտորի մեջ, ուստի ավելի ուշ Invitrogen-ը ներկայացրեց վեկտոր, որը կարող էր թիրախավորել կլոնավորումը, որը պարունակում էր չորս նշանավոր բազա GTGGS մի ծայրում:Հետևաբար, PCR պրայմերների նախագծման ժամանակ պետք է համապատասխանաբար ավելացվեն լրացուցիչ հաջորդականություններ, որպեսզի բեկորները կարողանան «կողմնորոշվել»:

Եթե ​​ժամանակի քիչ եք, կարող եք փորձել ուղղակի սինթեզ՝ համատեղելով գենը վեկտորի հետ, ինչը մենք անվանում ենք ET գենի սինթեզ մուսեկուլյարիստների մոտ:

D. In-Fusion կլոնավորման մեթոդ

Լիգազի կարիք չկա, երկար ռեակցիա չի պահանջվում:Քանի դեռ գծայինացված վեկտորի երկու ծայրերում հաջորդականություն է ներմուծվում պրայմերների նախագծման մեջ, այնուհետև PCR արտադրանքը և գծայինացված վեկտորը ավելացվում են BSA պարունակող ինֆուզիոն ֆերմենտային լուծույթի մեջ և տեղադրվում սենյակային ջերմաստիճանում կես ժամ, փոխակերպումը կարող է իրականացվել:Այս մեթոդը հատկապես հարմար է մեծ ծավալի փոխակերպման համար:

10. Միաձուլել այբբենարան

Երբեմն, այբբենարանի ձևավորման մասին հայտնի է միայն սահմանափակ հաջորդականության մասին տեղեկատվություն:Օրինակ, եթե հայտնի է միայն ամինաթթուների հաջորդականությունը, միաձուլվող այբբենարանը կարող է նախագծվել:Միաձուլման այբբենարանը տարբեր հաջորդականությունների խառնուրդ է, որը ներկայացնում է բազային բոլոր տարբեր հնարավորությունները, որոնք կոդավորում են մեկ ամինաթթու:Հատուկությունը մեծացնելու համար կարող եք դիմել կոդոնների օգտագործման աղյուսակին՝ միացումները նվազեցնելու համար՝ ըստ տարբեր օրգանիզմների բազային օգտագործման նախասիրությունների:Հիպոքսանտինը կարող է զուգակցվել բոլոր հիմքերի հետ՝ պրիմերի եռացման ջերմաստիճանը նվազեցնելու համար:Մի օգտագործեք կցված հիմքերը այբբենարանի 3′ վերջում, քանի որ վերջին 3 հիմքերի եռացումը 3′ ծայրում բավական է սխալ տեղանքում PCR սկսելու համար:Օգտագործվում են այբբենարանների ավելի բարձր կոնցենտրացիաներ (1μM-ից մինչև 3μM), քանի որ շատ միացվող խառնուրդներում այբբենարանները հատուկ չեն թիրախային ձևանմուշին:

PCR հումքվերահսկողություն

1. Այբբենարանի քանակությունը

Յուրաքանչյուր այբբենարանի կոնցենտրացիան 0.1 ~ 1 umol կամ 10 ~ 100pmol է:Ավելի լավ է ստանալ անհրաժեշտ արդյունքը նվազագույն քանակությամբ այբբենարանով:Պրայմերների բարձր կոնցենտրացիան կառաջացնի անհամապատասխանություն և ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում և կբարձրացնի պրայմերների միջև դիմերների ձևավորման հնարավորությունը:

2. Այբբենարանի կոնցենտրացիան

Պրայմերների կոնցենտրացիան ազդում է կոնկրետության վրա:Պրայմերների օպտիմալ կոնցենտրացիան սովորաբար 0,1-ից 0,5 մկմ է:Պրայմերների ավելի բարձր կոնցենտրացիաները հանգեցնում են ոչ սպեցիֆիկ արտադրանքների ուժեղացման:

3. Այբբենարանի հալման ջերմաստիճանը

Պրայմերների համար մեկ այլ կարևոր պարամետր է հալման ջերմաստիճանը (Tm):Սա այն ջերմաստիճանն է, երբ պրիմերների և լրացուցիչ հաջորդականությունների 50%-ը ներկայացված են որպես երկշղթա ԴՆԹ մոլեկուլներ:Tm-ը պահանջվում է PCR կռելու ջերմաստիճանը սահմանելու համար:Իդեալում, եռացման ջերմաստիճանը բավական ցածր է, որպեսզի ապահովի այբբենարանների արդյունավետ եռացումը նպատակային հաջորդականությամբ, բայց բավականաչափ բարձր՝ ոչ սպեցիֆիկ կապը նվազեցնելու համար:Զրման ողջամիտ ջերմաստիճան 55℃-ից մինչև 70℃:Հալման ջերմաստիճանը սովորաբար սահմանվում է 5℃ ցածր, քան այբբենարանի Tm-ը:

Կան մի քանի բանաձևեր Tm-ի սահմանման համար, որոնք մեծապես տարբերվում են՝ կախված օգտագործվող բանաձևից և պրայմերների հաջորդականությունից:Քանի որ բանաձևերի մեծ մասը տրամադրում է գնահատված Tm արժեք, եռացման բոլոր ջերմաստիճանները միայն մեկնարկային կետ են:Հատուկությունը կարող է բարելավվել՝ վերլուծելով մի քանի ռեակցիաներ, որոնք աստիճանաբար բարձրացնում են եռացման ջերմաստիճանը:Սկսեք գնահատված Tm-5℃-ից ցածր և աստիճանաբար բարձրացրեք եռացման ջերմաստիճանը 2℃ աստիճանով:Զրման ավելի բարձր ջերմաստիճանը կնվազեցնի այբբենարանի դիմերների և ոչ հատուկ արտադրանքների ձևավորումը:Լավագույն արդյունքների համար երկու այբբենարանները պետք է ունենան մոտավոր Tm արժեքներ:Եթե ​​այբբենարանների զույգերի Tm տարբերությունը 5℃-ից ավելի է, ապա այբբենարանները ցույց կտան զգալի սխալ մեկնարկ՝ օգտագործելով ցիկլում եռացման ավելի ցածր ջերմաստիճան:Եթե ​​երկու այբբենարանները տարբերվում են Tm-ից, ապա հալման ջերմաստիճանը սահմանեք ամենացածր Tm-ից 5℃ ցածր:Որպես այլընտրանք, յուրահատկությունը մեծացնելու համար կարող են նախ հինգ ցիկլեր իրականացվել ավելի բարձր Tm-ի համար նախատեսված եռացման ջերմաստիճանում, որին հաջորդում են մնացած ցիկլերը ցածր Tm-ի համար նախատեսված եռացման ջերմաստիճանում:Սա թույլ է տալիս ստանալ նպատակակետի կաղապարի մասնակի պատճենը խիստ պայմաններում:

4. Այբբենարանի մաքրությունը և կայունությունը

Պատվերով պրայմերների ստանդարտ մաքրությունը համարժեք է PCR կիրառությունների մեծ մասի համար:Բենզոիլային և իզոբուտիլիլային խմբերի հեռացումը աղազերծման միջոցով նվազագույն է և, հետևաբար, չի խանգարում PCR-ին:Որոշ հավելվածներ պահանջում են մաքրում, որպեսզի հեռացնեն սինթեզի գործընթացում ոչ ամբողջական հաջորդականությունը:Այս կտրված հաջորդականությունները տեղի են ունենում այն ​​պատճառով, որ ԴՆԹ-ի սինթեզի քիմիայի արդյունավետությունը 100% չէ:Սա շրջանաձև գործընթաց է, որն օգտագործում է կրկնվող քիմիական ռեակցիաներ, երբ յուրաքանչյուր հիմք ավելացվում է ԴՆԹ-ի 3′-ից մինչև 5′ ձևավորման համար:Դուք կարող եք ձախողվել ցանկացած ցիկլում:Ավելի երկար այբբենարաններ, հատկապես նրանք, ովքեր ունեն 50 հիմքից ավելի, ունեն կտրված հաջորդականությունների մեծ մասնաբաժին և կարող են պահանջել մաքրում:

Պրայմերների եկամտաբերության վրա ազդում է սինթետիկ քիմիայի և մաքրման մեթոդի արդյունավետությունը:Կենսադեղագործական ընկերությունները, ինչպիսիք են Cytology-ը և Shengong-ը, բոլորն օգտագործում են նվազագույն OD միավոր՝ ապահովելու օլիգոնուկլեոզիդի ընդհանուր արտադրանքը:Պատվերով այբբենարանները առաքվում են չոր փոշու տեսքով:Լավագույնն այն է, որ այբբենարանները նորից լուծվեն TE-ում, որպեսզի վերջնական կոնցենտրացիան լինի 100 մկՄ:TE-ն ավելի լավ է, քան դեիոնացված ջուրը, քանի որ ջրի pH-ը հաճախ թթվային է և կառաջացնի օլիգոնուկլեոզիդների հիդրոլիզ:

Պրայմերների կայունությունը կախված է պահպանման պայմաններից:Չոր փոշին և լուծված պրայմերները պետք է պահվեն -20℃ ջերմաստիճանում:10μM-ից ավելի կոնցենտրացիաներում TE-ում լուծված այբբենարանները կարող են կայունորեն պահպանվել -20℃ ջերմաստիճանում 6 ամիս, բայց կարող են պահվել միայն սենյակային ջերմաստիճանում (15℃-ից մինչև 30℃) 1 շաբաթից պակաս:Չոր փոշի պրայմերները կարող են պահվել -20 C ջերմաստիճանում առնվազն 1 տարի և սենյակային ջերմաստիճանում (15 C-ից 30 C) մինչև 2 ամիս:

5. Ֆերմենտներ և դրանց կոնցենտրացիաներ

Ներկայումս օգտագործվող Taq ԴՆԹ պոլիմերազը հիմնականում կոլիֆորմ բակտերիաների կողմից սինթեզված գենային ինժեներական ֆերմենտ է:Տիպիկ PCR ռեակցիան կատալիզացնելու համար անհրաժեշտ ֆերմենտի քանակը մոտ 2,5 U է (վերաբերում է 100 մլ ռեակցիայի ընդհանուր ծավալին):Եթե ​​կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, դա կարող է հանգեցնել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման;եթե կոնցենտրացիան չափազանց ցածր է, սինթետիկ արտադրանքի քանակը կնվազի:

6. dNTP-ի որակը և կոնցենտրացիան

dNTP-ի որակը սերտորեն կապված է PCR ուժեղացման կոնցենտրացիայի և արդյունավետության հետ:dNTP փոշին հատիկավոր է, և դրա փոփոխականությունը կորցնում է իր կենսաբանական ակտիվությունը, եթե այն ոչ պատշաճ պահվի:dNTP լուծույթը թթվային է և պետք է օգտագործվի բարձր կոնցենտրացիաներում՝ 1M NaOH կամ 1M Tris.HCL բուֆերային լուծույթով, որպեսզի կարգավորի իր PH-ը մինչև 7,0 ~ 7,5, փոքր քանակությամբ ենթափաթեթավորում, սառեցված պահեստավորում -20℃:Բազմաթիվ սառեցում-հալեցումը կնվազեցնի dNTP-ն:PCR ռեակցիայի ժամանակ dNTP-ն պետք է լինի 50 ~ 200 umol/L:Հատկապես պետք է ուշադրություն դարձնել, որ չորս DNTPS-ների կոնցենտրացիան պետք է լինի հավասար (հավասար մոլի պատրաստում):Եթե ​​դրանցից որևէ մեկի կոնցենտրացիան տարբերվում է մյուսներից (ավելի բարձր կամ ցածր), կառաջանա անհամապատասխանություն:Չափազանց ցածր կոնցենտրացիան կնվազեցնի PCR արտադրանքի եկամտաբերությունը:dNTP-ն կարող է միավորվել Mg2+-ի հետ և նվազեցնել ազատ Mg2+-ի կոնցենտրացիան:

7. Կաղապար (թիրախային գեն) նուկլեինաթթու

Կաղապարային նուկլեինաթթվի քանակը և մաքրման աստիճանը PCR-ի հաջողության կամ ձախողման առանցքային օղակներից մեկն է:ԴՆԹ-ի մաքրման ավանդական մեթոդները սովորաբար օգտագործում են SDS և պրոթեզերոն K նմուշները մարսելու և տնօրինելու համար:SDS-ի հիմնական գործառույթներն են՝ լուծել լիպիդները և սպիտակուցները բջջային մեմբրանի վրա՝ այդպիսով ոչնչացնելով բջջային թաղանթը՝ լուծարելով մեմբրանի սպիտակուցները, և դիսոցացնել միջուկային սպիտակուցները բջջում, SDS-ը կարող է նաև միավորվել սպիտակուցների հետ և նստվածք առաջացնել;Պրոտեազ K-ն կարող է հիդրոլիզացնել և մարսել սպիտակուցները, հատկապես ԴՆԹ-ի հետ կապված հիստոնները, այնուհետև օգտագործել օրգանական լուծիչ ֆենոլ և քլորոֆորմ՝ սպիտակուցներ և բջջային այլ բաղադրիչներ արդյունահանելու համար, և օգտագործել էթանոլ կամ իզոպրոպիլ սպիրտ՝ նուկլեինաթթու նստեցնելու համար:Արդյունահանված նուկլեինաթթուն կարող է օգտագործվել որպես PCR ռեակցիաների ձևանմուշ:Ընդհանուր կլինիկական հայտնաբերման նմուշների համար արագ և պարզ մեթոդ կարող է օգտագործվել բջիջները լուծարելու, պաթոգենները լուծարելու, քրոմոսոմներից սպիտակուցները մարսելու և հեռացնելու համար մինչև ազատ թիրախային գեները և ուղղակիորեն օգտագործվել PCR ամպլիֆիկացիայի համար:ՌՆԹ կաղապարի արդյունահանումը սովորաբար օգտագործում է գուանիդին իզոթիոցիանատ կամ պրոթեզերազ K մեթոդ՝ կանխելու RNase-ի դեգրադացումը ՌՆԹ-ն:

8.Mg2+ կոնցենտրացիան

Mg2+-ը զգալի ազդեցություն ունի PCR ուժեղացման առանձնահատկությունների և եկամտաբերության վրա:Ընդհանուր PCR ռեակցիայի դեպքում, երբ տարբեր dNTP-ների կոնցենտրացիան 200 մմոլ/լ է, Mg2+-ի համապատասխան կոնցենտրացիան 1,5 ~ 2,0 մմոլ/լ է:Mg2+ կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, ռեակցիայի առանձնահատկությունը նվազում է, տեղի է ունենում ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում, չափազանց ցածր կոնցենտրացիան կնվազեցնի Taq ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվությունը, ինչը կհանգեցնի ռեակցիայի արտադրանքի կրճատմանը:

Մագնեզիումի իոնները ազդում են PCR-ի մի քանի ասպեկտների վրա, օրինակ՝ ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվության վրա, որն ազդում է եկամտաբերության վրա.Մեկ այլ օրինակ է այբբենարանի կռումը, որն ազդում է կոնկրետության վրա:dNTP-ն և կաղապարը կապվում են մագնեզիումի իոնի հետ՝ նվազեցնելով ազատ մագնեզիումի իոնի քանակը, որն անհրաժեշտ է ֆերմենտի գործունեության համար։Մագնեզիումի իոնների օպտիմալ կոնցենտրացիան տատանվում է տարբեր պրայմերների զույգերի և ձևանմուշների համար, սակայն 200 μM dNTP-ով տիպիկ PCR սկզբնական կոնցենտրացիան 1,5 մՄ է (նշում. իրական ժամանակում քանակական PCR-ի համար օգտագործեք 3-ից 5 մՄ մագնեզիումի իոնային լուծույթ՝ լյումինեսցենտային զոնդով):Ազատ մագնեզիումի իոնների ավելի բարձր կոնցենտրացիաները մեծացնում են բերքատվությունը, բայց նաև մեծացնում են ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը և նվազեցնում հավատարմությունը:Օպտիմալ կոնցենտրացիան որոշելու համար մագնեզիումի իոնների տիտրումները կատարվել են 0,5մՄ-ով 1մՄ-ից մինչև 3մՄ:Մագնեզիումի իոնների օպտիմալացումից կախվածությունը նվազեցնելու համար կարող է օգտագործվել Platinum Taq ԴՆԹ պոլիմերազը:Platinum Taq ԴՆԹ պոլիմերազը ի վիճակի է պահպանել գործառույթը մագնեզիումի իոնների կոնցենտրացիաների ավելի լայն շրջանակում, քան Taq ԴՆԹ պոլիմերազը, և, հետևաբար, պահանջում է ավելի քիչ օպտիմալացում:

9. Pcr խթանող հավելումներ

Եռացման ջերմաստիճանի, այբբենարանի ձևավորման և մագնեզիումի իոնների կոնցենտրացիայի օպտիմիզացումը բավարար է կաղապարների մեծ մասի խիստ հատուկ ուժեղացման համար.Այնուամենայնիվ, որոշ ձևանմուշներ, ներառյալ բարձր GC պարունակություն ունեցողները, պահանջում են լրացուցիչ միջոցներ:ԴՆԹ-ի հալման ջերմաստիճանի վրա ազդող հավելումները ապահովում են արտադրանքի առանձնահատկությունն ու բերքատվությունը բարելավելու ևս մեկ միջոց:Լավագույն արդյունքների համար անհրաժեշտ է կաղապարի ամբողջական դենատորացիա:

Բացի այդ, երկրորդական կառուցվածքը կանխում է այբբենարանի կապը և ֆերմենտի երկարացումը:

PCR հավելումները, ներառյալ ֆորմամիդը, DMSO, գլիցերինը, բետաինը և PCRx ուժեղացուցիչ լուծույթը, ուժեղացնում են ուժեղացումը:Դրանց հնարավոր մեխանիզմը հալման ջերմաստիճանի նվազեցումն է, այդպիսով նպաստելով այբբենարանների եռացմանը և օժանդակելով ԴՆԹ պոլիմերազի ընդլայնմանը երկրորդական կառուցվածքի տարածքում:PCRx Solution-ն ունի այլ առավելություններ.Պահանջվում է մագնեզիումի իոնների նվազագույն օպտիմալացում, երբ օգտագործվում է Platinum Taq ԴՆԹ պոլիմերազի և Platinum Pfx ԴՆԹ պոլիմերազի հետ:Այսպիսով, Platinum տեխնիկան զուգակցվում է հավելանյութի հետ՝ բարձրացնելու յուրահատկությունը՝ միաժամանակ նվազեցնելով երրորդ մոտեցման՝ մագնեզիումի իոնների օպտիմալացման կախվածությունը:Լավագույն արդյունքների համար հավելումների կոնցենտրացիան պետք է օպտիմալացվի, հատկապես DMSO-ն, ֆորմամիդը և գլիցերինը, որոնք արգելակում են Taq ԴՆԹ պոլիմերազը:

 Foreasy Taq ԴՆԹ պոլիմերազ

10. Թեժ մեկնարկ

Hot start PCR-ը PCR-ի առանձնահատկությունը բարելավելու ամենակարևոր մեթոդներից մեկն է, ի լրումն այբբենարանի լավ ձևավորման:Չնայած Taq ԴՆԹ պոլիմերազի երկարացման օպտիմալ ջերմաստիճանը 72℃ է, պոլիմերազը մնում է ակտիվ սենյակային ջերմաստիճանում:Այսպիսով, ոչ սպեցիֆիկ արտադրանքներ են արտադրվում, երբ ՊՇՌ ռեակցիայի պատրաստման և ջերմային ցիկլի սկզբում պահման ջերմաստիճանը ցածր է եռացման ջերմաստիճանից:Ձևավորվելուց հետո այս ոչ սպեցիֆիկ արտադրանքները արդյունավետորեն ուժեղացվում են:Hot-start PCR-ը հատկապես արդյունավետ է, երբ պրայմերների նախագծման համար օգտագործվող տեղամասերը սահմանափակված են գենետիկ տարրերի տեղակայմամբ, ինչպիսիք են տեղանքին ուղղված մուտացիաները, արտահայտման կլոնավորումը կամ ԴՆԹ ճարտարագիտության համար օգտագործվող գենետիկ տարրերի կառուցումն ու մանիպուլյացիան:

Taq ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվությունը սահմանափակելու ընդհանուր մեթոդը սառույցի վրա PCR ռեակցիայի լուծույթ պատրաստելն է և այն նախապես տաքացված PCR ապարատի մեջ դնելը:Այս մեթոդը պարզ է և էժան, բայց այն չի ավարտում ֆերմենտի ակտիվությունը և, հետևաբար, ամբողջությամբ չի վերացնում ոչ հատուկ արտադրանքի ուժեղացումը:

Ջերմային պրիմինգը հետաձգում է ԴՆԹ-ի սինթեզը՝ արգելակելով էական բաղադրիչը, մինչև PCR ապարատը հասնի դենատուրացիայի ջերմաստիճանի:Ձեռքով ջերմային մեկնարկի մեթոդների մեծ մասը, ներառյալ Taq ԴՆԹ պոլիմերազի հետաձգված ավելացումը, դժվար է, հատկապես բարձր թողունակության կիրառման համար:Ջերմային պրիմինգի այլ մեթոդներ օգտագործում են մոմի վահան՝ հիմնական բաղադրիչը, ներառյալ մագնեզիումի իոնները կամ ֆերմենտները, կամ ռեակտիվ բաղադրիչները, ինչպիսիք են կաղապարները և բուֆերները, ֆիզիկապես մեկուսացնելու համար:Ջերմային ցիկլի ընթացքում տարբեր բաղադրիչներն ազատվում են և խառնվում, քանի որ մոմը հալվում է:Ինչպես ձեռքով տաք մեկնարկի մեթոդը, մոմի վահանի մեթոդը ծանր է և հակված աղտոտման և հարմար չէ բարձր թողունակությամբ կիրառությունների համար:

Պլատինի ԴՆԹ պոլիմերազը հարմար և արդյունավետ է ավտոմատ տաք մեկնարկի PCR-ի համար:Platinum Taq ԴՆԹ պոլիմերազը բաղկացած է ռեկոմբինանտ Taq ԴՆԹ պոլիմերազից՝ համակցված Taq ԴՆԹ պոլիմերազի դեմ մոնոկլոնալ հակամարմինների հետ:Հակամարմինները ձևավորվում են PCR-ով, որպեսզի արգելակեն ֆերմենտի ակտիվությունը երկարատև ջերմաստիճանի պահպանման ժամանակ:Taq ԴՆԹ պոլիմերազը արձակվել է ռեակցիայի մեջ դենատուրացիայի փուլի 94℃ մեկուսացման ժամանակ՝ վերականգնելով պոլիմերազի ամբողջական ակտիվությունը:Ի տարբերություն քիմիապես ձևափոխված Taq ԴՆԹ պոլիմերազի՝ ջերմային մեկնարկի համար, պլատինե ֆերմենտը չի պահանջում երկարատև մեկուսացում 94℃ (10-ից 15 րոպե)՝ պոլիմերազը ակտիվացնելու համար:PlatinumTaq ԴՆԹ պոլիմերազով Taq ԴՆԹ պոլիմերազի ակտիվության 90%-ը վերականգնվել է 2 րոպե հետո 94℃ ջերմաստիճանում:

Foreasy HS Taq ԴՆԹ պոլիմերազ

11. Nest-PCR

Ուժեղացման հաջորդական փուլերը՝ օգտագործելով nested primers, կարող են բարելավել յուրահատկությունը և զգայունությունը:Առաջին փուլը 15-ից 20 ցիկլերի ստանդարտ ուժեղացում է:Նախնական ուժեղացման արտադրանքի մի փոքր մասը նոսրացվել է 100-ից 1000 անգամ և ավելացվել է ուժեղացման երկրորդ փուլին 15-ից 20 ցիկլով:Որպես այլընտրանք, նախնական ուժեղացված արտադրանքը կարող է չափվել գելային մաքրման միջոցով:Ամրապնդման երկրորդ փուլում օգտագործվում է բույն դրված այբբենարան, որը կարող է կապվել առաջին այբբենարանի ներսում գտնվող թիրախային հաջորդականության հետ:Nested PCR-ի օգտագործումը նվազեցնում է բազմաթիվ թիրախային տեղամասերի ուժեղացման հնարավորությունը, քանի որ կան մի քանի թիրախային հաջորդականություններ, որոնք լրացնում են պրայմերների երկու խմբերը:Նույն ընդհանուր թվով ցիկլեր (30-ից 40) նույն այբբենարաններով ուժեղացրել են ոչ սպեցիֆիկ տեղամասերը:Nested PCR-ը մեծացնում է սահմանափակ թիրախային հաջորդականությունների զգայունությունը (օրինակ՝ հազվագյուտ մռնա) և բարելավում է դժվարին PCRS-ի առանձնահատկությունը (օրինակ՝ 5' RACE):

12. Նվազող ՊՇՌ

Նվազող ՊՇՌ-ն բարելավում է յուրահատկությունը՝ օգտագործելով ՊՇՌ-ի առաջին մի քանի ցիկլերի համար կոշտ եռացման պայմանները:Ցիկլը սկսվում է եռացման ջերմաստիճանից մոտավորապես 5℃ ավելի բարձր, քան գնահատված Tm-ը, այնուհետև յուրաքանչյուր ցիկլ կրճատվում է 1℃-ով մինչև 2℃, մինչև եռացման ջերմաստիճանը Tm 5℃-ից ցածր լինի:Կուժեղացվի միայն ամենաբարձր հոմոլոգիա ունեցող նպատակակետի ձևանմուշը:Այս ապրանքները շարունակում են ընդլայնվել հետագա ցիկլերում՝ դուրս մղելով ուժեղացված ոչ հատուկ արտադրանքները:Նվազող ՊՇՌ-ն օգտակար է այն մեթոդների համար, որտեղ հայտնի չէ պրայմերների և թիրախային ձևանմուշների միջև հոմոլոգիայի աստիճանը, օրինակ՝ AFLP ԴՆԹ մատնահետքերը:

Առնչվող PCR փաթեթներ

 PCR Easyᵀᴹ (Ներկանյութով)

2× PCR հերոսը^TMMix համակարգը ավելի բարձր հանդուրժողականություն ունի PCR ինհիբիտորների նկատմամբ, քան սովորական PCR Mix համակարգը և կարող է հեշտությամբ հաղթահարել տարբեր բարդ ձևանմուշների PCR ուժեղացումը:Եզակի ռեակցիայի համակարգը և բարձր արդյունավետությամբ Taq Hero-ն ստիպում են PCR ռեակցիան ունենալ ուժեղացման ավելի բարձր արդյունավետություն, առանձնահատկություն և զգայունություն:

 PCR Heroᵀᴹ (ներկանյութով)

Ուժեղացման ավելի բարձր արդյունավետություն

Այն ունի 5'→3' ԴՆԹ պոլիմերազային ակտիվություն և 5'→3' էկզոնուկլեազային ակտիվություն՝ առանց 3'→5' էկզոնուկլեազային ակտիվության։

Իրական ժամանակում PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Հատուկ՝ օպտիմիզացված բուֆեր և տաք մեկնարկի Taq ֆերմենտը կարող է կանխել ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը և պրայմերային դիմերի ձևավորումը

Բարձր զգայունություն. կարող է հայտնաբերել կաղապարի ցածր պատճենները

RT-PCR Easyᵀᴹ I (Մեկ քայլ)

Հավաքածուն օգտագործում է եզակի Foregene հակադարձ տրանսկրիպցիոն ռեագենտ և Foregene HotStar Taq ԴՆԹ պոլիմերազ՝ զուգակցված յուրահատուկ ռեակցիայի համակարգի հետ՝ արդյունավետորեն բարելավելու ռեակցիայի ուժեղացման արդյունավետությունն ու առանձնահատկությունը: