Ուժեղացման ազդանշաններ չկան

1. Կոմպլեկտի մեջ գտնվող Taq DNA պոլիմերազը կորցնում է իր ակտիվությունը ոչ պատշաճ պահպանման կամ փաթեթի ժամկետը լրանալու պատճառով:
Առաջարկություն. Հաստատեք փաթեթի պահպանման պայմանները.կրկին ավելացրեք Taq DNA պոլիմերազի համապատասխան քանակությունը PCR համակարգին կամ գնեք նոր իրական ժամանակի PCR հավաքածու համապատասխան փորձերի համար:

2. ԴՆԹ-ի կաղապարում կան Taq ԴՆԹ պոլիմերազի բազմաթիվ արգելիչներ:
Առաջարկ. Մաքրել կաղապարը կամ նվազեցնել օգտագործվող կաղապարի քանակը:

3. Mg2+ կոնցենտրացիան հարմար չէ:
Առաջարկություն. Մեր տրամադրած 2× իրական PCR խառնուրդի Mg2+ կոնցենտրացիան 3,5 մՄ է:Այնուամենայնիվ, որոշ հատուկ այբբենարանների և ձևանմուշների համար Mg2+ կոնցենտրացիան կարող է ավելի բարձր լինել:Հետևաբար, Mg2+ կոնցենտրացիան օպտիմալացնելու համար կարող եք ուղղակիորեն ավելացնել MgCl2:Օպտիմալացման համար խորհուրդ է տրվում ամեն անգամ ավելացնել Mg2+ 0,5 մՄ:

4. PCR-ի ուժեղացման պայմանները հարմար չեն, և այբբենարանի հաջորդականությունը կամ կոնցենտրացիան սխալ է:
Առաջարկ. հաստատել այբբենարանի հաջորդականության ճիշտությունը և այբբենարանը չի քայքայվել;եթե ուժեղացման ազդանշանը լավ չէ, փորձեք իջեցնել եռացման ջերմաստիճանը և պատշաճ կերպով կարգավորել այբբենարանի կոնցենտրացիան:

5. Կաղապարի քանակը չափազանց քիչ է կամ շատ:
Առաջարկություն. Կատարեք ձևանմուշի գծայինացման գրադիենտ նոսրացում և ընտրեք կաղապարի կոնցենտրացիան լավագույն PCR էֆեկտով իրական ժամանակում PCR փորձի համար:

NTC-ն ունի չափազանց բարձր լյումինեսցենտային արժեք

1. Գործողության ընթացքում առաջացած ռեագենտով աղտոտվածություն:
Առաջարկություն. Փոխարինեք նոր ռեագենտներով իրական ժամանակում PCR փորձերի համար:

2. ՊՇՌ ռեակցիայի համակարգի պատրաստման ժամանակ տեղի է ունեցել աղտոտում:
Առաջարկություն. Գործողության ընթացքում ձեռնարկել անհրաժեշտ պաշտպանիչ միջոցներ, ինչպիսիք են՝ կրել լատեքսային ձեռնոցներ, օգտագործել ֆիլտրով պիպետտի ծայրը և այլն:

3. Պրայմերները քայքայված են, և պրայմերների քայքայումը կառաջացնի ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում:
Առաջարկ. Օգտագործեք SDS-PAGE էլեկտրոֆորեզ՝ պարզելու, թե արդյոք պրայմերները քայքայված են, և դրանք փոխարինեք նոր պրայմերներով իրական ժամանակում PCR փորձերի համար:

Primer dimer կամ ոչ հատուկ ուժեղացում

1. Mg2+ կոնցենտրացիան հարմար չէ:
Առաջարկություն. Մեր տրամադրած 2× Real PCR EasyTM Mix-ի Mg2+ կոնցենտրացիան 3,5 մՄ է:Այնուամենայնիվ, որոշ հատուկ այբբենարանների և ձևանմուշների համար Mg2+ կոնցենտրացիան կարող է ավելի բարձր լինել:Հետևաբար, Mg2+ կոնցենտրացիան օպտիմալացնելու համար կարող եք ուղղակիորեն ավելացնել MgCl2:Օպտիմալացման համար խորհուրդ է տրվում ամեն անգամ ավելացնել Mg2+ 0,5 մՄ:

2. PCR կռելու ջերմաստիճանը չափազանց ցածր է:
Առաջարկ. Ամեն անգամ բարձրացրե՛ք PCR եռացման ջերմաստիճանը 1℃ կամ 2℃-ով:

3. PCR արտադրանքը չափազանց երկար է:
Առաջարկություն. Իրական ժամանակում PCR արտադրանքի երկարությունը պետք է լինի 100-150 bp, ոչ ավելի, քան 500 bp:

4. Պրայմերները քայքայված են, և պրայմերների քայքայումը կհանգեցնի հատուկ ուժեղացման տեսքին:
Առաջարկ. Օգտագործեք SDS-PAGE էլեկտրոֆորեզ՝ պարզելու, թե արդյոք պրայմերները քայքայված են, և դրանք փոխարինեք նոր պրայմերներով իրական ժամանակում PCR փորձերի համար:

5. PCR համակարգը սխալ է, կամ համակարգը չափազանց փոքր է:
Առաջարկ. PCR ռեակցիայի համակարգը չափազանց փոքր է, ինչը կհանգեցնի հայտնաբերման ճշգրտության նվազմանը:Ավելի լավ է օգտագործել քանակական PCR գործիքի կողմից առաջարկվող ռեակցիայի համակարգը իրական ժամանակում PCR փորձը վերագործարկելու համար:

Քանակական արժեքների վատ կրկնելիություն

1. Գործիքը անսարք է:
Առաջարկ. գործիքի յուրաքանչյուր PCR անցքի միջև կարող են լինել սխալներ, ինչը հանգեցնում է վատ վերարտադրելիության ջերմաստիճանի կառավարման կամ հայտնաբերման ժամանակ:Խնդրում ենք ստուգել համապատասխան գործիքի ցուցումների համաձայն:

2. Նմուշի մաքրությունը լավ չէ:
Առաջարկություն. Անմաքուր նմուշները կհանգեցնեն փորձի վատ վերարտադրելիության, որը ներառում է կաղապարի և այբբենարանների մաքրությունը:Լավագույնն այն է, որ կաղապարը վերամաքրվի, իսկ այբբենարանները լավագույնս մաքրվում են SDS-PAGE-ով:

3. PCR համակարգի պատրաստման և պահպանման ժամանակը չափազանց երկար է:
Առաջարկ. Օգտագործեք Real Time PCR համակարգը PCR փորձի համար պատրաստվելուց անմիջապես հետո և մի թողեք այն շատ երկար:

4. PCR-ի ուժեղացման պայմանները հարմար չեն, և այբբենարանի հաջորդականությունը կամ կոնցենտրացիան սխալ է:
Առաջարկ. հաստատել այբբենարանի հաջորդականության ճիշտությունը և այբբենարանը չի քայքայվել;եթե ուժեղացման ազդանշանը լավ չէ, փորձեք իջեցնել եռացման ջերմաստիճանը և պատշաճ կերպով կարգավորել այբբենարանի կոնցենտրացիան:

5. PCR համակարգը սխալ է, կամ համակարգը չափազանց փոքր է:
Առաջարկ. PCR ռեակցիայի համակարգը չափազանց փոքր է, ինչը կհանգեցնի հայտնաբերման ճշգրտության նվազմանը:Ավելի լավ է օգտագործել քանակական PCR գործիքի կողմից առաջարկվող ռեակցիայի համակարգը իրական ժամանակում PCR փորձը վերագործարկելու համար: