RT-qPCR փորձը ներառում է ՌՆԹ արդյունահանում և որակի գնահատում, հակադարձ տառադարձում և qPCR երեք քայլ, յուրաքանչյուր քայլ ունի բազմաթիվ նախազգուշական միջոցներ, մենք մանրամասն կներկայացնենք ստորև:

Ⅰ.ՌՆԹ որակի գնահատում

RT-qPCR փորձարկում, ՌՆԹ-ի արդյունահանման ավարտից հետո, ՌՆԹ-ի որակը պետք է գնահատվի, և հետագա փորձը կարող է իրականացվել միայն այն որակավորվելուց հետո:Գնահատման մեթոդները ներառում են սպեկտրոֆոտոմետր, Agilent գել էլեկտրոֆորեզ, Agilent 2100 վերլուծություն, որոնց թվում են առավել հաճախ օգտագործվող սպեկտրոֆոտոմետրը և ագարոզայի գել էլեկտրոֆորեզի մեթոդի հայտնաբերումը:Հարկ է նշել, որ այս երկու մեթոդները պետք է օգտագործվեն միասին՝ ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիայի, մաքրության և ամբողջականության հայտնաբերումն ու վերլուծությունն ավարտելու համար, որպեսզի ապահովվի ՌՆԹ-ի որակը:

Առնչվող ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու. 

Բջջի ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու

Բարձր մաքրված և բարձրորակ ընդհանուր ՌՆԹ-ն կարելի է ձեռք բերել տարբեր կուլտուրական բջիջներից 11 րոպեում:

Կենդանիների ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու

Արագ և արդյունավետ կերպով արդյունահանեք բարձր մաքրության և բարձրորակ ընդհանուր ՌՆԹ տարբեր կենդանիների հյուսվածքներից:

Սպեկտրոֆոտոմետր:

Սպեկտրոֆոտոմետրը հիմնականում օգտագործվում է ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան և մաքրությունը որոշելու համար, սակայն այն չի կարող հայտնաբերել ՌՆԹ-ի և գենոմի մնացորդի ամբողջականությունը:Դրանցից A260/280 և A260/230 կարևոր պարամետրեր են ՌՆԹ-ի մաքրության հայտնաբերման համար, և ՌՆԹ-ի մաքրությունը կարելի է հայտնաբերել՝ ըստ դրանց արժեքների տատանումների.

1. 1.9< A260/280< 2.1, որը ցույց է տալիս, որ ՌՆԹ-ի մաքրությունը լավ է;A260/280<1.9, ինչը ցույց է տալիս, որ ՌՆԹ-ում կարող է լինել սպիտակուցի մնացորդ;A260/280>2.1, որը ցույց է տալիս ՌՆԹ-ի հնարավոր մասնակի քայքայումը, որը կարող է հետագայում հաստատվել ագարոզայի գելային էլեկտրոֆորեզով:

2. 2.0< A260/230< 2.2, որը ցույց է տալիս, որ ՌՆԹ-ի մաքրությունը լավ է;A260/230< 2.0, որը ցույց է տալիս, որ ՌՆԹ-ում կարող են լինել օրգանական ռեակտիվների մնացորդներ, ինչպիսիք են ֆենոլները, էթանոլը կամ շաքարները:

Ագարոզայի գել էլեկտրոֆորեզ.

Ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզի անալիզը կարող է վերլուծել ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը, գենոմը և սպիտակուցի մնացորդները, բայց չի կարող ճշգրիտ չափել ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան կամ հայտնաբերել օրգանական ռեակտիվների մնացորդները:Օրինակ վերցրեք էուկարիոտիկ ՌՆԹ կաղապարներ.

1. ՌՆԹ-ն ենթարկվել է ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզի:Եթե ​​գել քարտեզի վրա կային 28sRNA, 18sRNA և 5.8sRNA միայն երեք առանձին ժապավեններ, դա ցույց է տալիս, որ արդյունահանված ՌՆԹ-ն անձեռնմխելի է:Եթե ​​կա ձգող երեւույթ, դա վկայում է ՌՆԹ-ի մասնակի դեգրադացիայի մասին:

2. Եթե սոսնձի անցքի և 28sRNA ժապավենի միջև կա մեկ պայծառ գոտի, կարող է լինել գենոմային ԴՆԹ մնացորդ:

3. Եթե սոսինձի փոսում շերտեր են հայտնվում, դա ցույց է տալիս, որ կարող են լինել սպիտակուցի և այլ մակրոմոլեկուլային նյութերի մնացորդներ:

Ⅱ. Հակադարձ արտագրում

ՌՆԹ-ի արդյունահանման ավարտից հետո այն պետք է վերածվի cDNA-ի հետագա փորձերի համար, ուստի հակադարձ քայլը կարևոր է:Հակադարձ տրանսկրիպցիան կներկայացվի հակադարձ տրանսկրիպտազի և այբբենարանի ընտրությունից.

Հակադարձ տրանսկրիպտազի ընտրություն.

Տիպիկ հակադարձ տրանսկրիպտազները ներառում են AMV RTase և MMLV RTase:AMV RTase-ի RNase H-ն ունի ուժեղ ակտիվություն, սինթեզի կարճ երկարություն, ցածր սինթեզի քանակություն և լավ ջերմային կայունություն (42 ~ 55℃):MMLV RTase-ի RNase H ակտիվությունը թույլ է, սինթեզի երկարությունը երկար է, սինթեզի քանակությունը բարձր է, և ջերմային կայունությունը վատ է (37 ~ 42℃):

Քանի որ RNase H ֆերմենտը ունի ՌՆԹ-ի դեգրադացման գործառույթ, թույլ RNase H ակտիվությամբ MMLV-ն պետք է նախընտրելիորեն ընտրվի հակադարձ տրանսկրիպցիայի ժամանակ, և հետագայում գենետիկական ինժեներիայից հետո MMLV-ի ջերմային կայունությունը հասել է որակական թռիչքի:Foregene-ի ընդունումForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV հակադարձ տառադարձման համար) Որպես օրինակ, դա նոր հակադարձ տրանսկրիպտազ է, որն արտահայտված է E. coli-ի մշակված բակտերիաներում՝ օգտագործելով գենետիկական ռեկոմբինացիայի տեխնոլոգիա:Այն ռեկոմբինանտ ԴՆԹ պոլիմերազ է, որը սինթեզում է միաշղթա ՌՆԹ-ից, ԴՆԹ-ից կամ ՌՆԹ:ԴՆԹ հիբրիդից լրացուցիչ ԴՆԹ շղթա:Այն չունի RNase H ակտիվություն, ուժեղ կայունություն, ուժեղ ՌՆԹ-ի մերձեցում և բարձր հայտնաբերման զգայունություն:

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV հակադարձ տառադարձման համար)

Այբբենարանի ընտրություն.

Ընդհանուր առմամբ RT պրայմերները բաժանվում են երեք կատեգորիաների՝ օլիգո dT, պատահական պրայմերներ և գենային հատուկ պրայմերներ:Ընտրեք համապատասխան այբբենարաններ օգտագործման համար՝ ըստ տարբեր փորձարարական պահանջների:

1. Եթե ձևանմուշը էուկարիոտիկ ծագում ունի, և ուշ cDNA-ն օգտագործվում է սովորական PCR ուժեղացման համար, խորհուրդ է տրվում Oligo (dT);Եթե ​​հետագա փորձը օգտագործվում է միայն qPCR-ի համար, ապա Oligo (dT) խորհուրդ է տրվում խառնել պատահական պրայմերների հետ՝ հակադարձ տառադարձման արդյունավետությունը բարելավելու համար:

2. Եթե ձևանմուշը պրոկարիոտներից է, ապա հակադարձ տրանսկրիպցիայի համար պետք է ընտրվեն Random Primers կամ գենային հատուկ պրայմերներ:

Ⅲ.qPCR

Ֆլյուորեսցենտային քանակականացումը հիմնականում մշակվել է քանակական մեթոդների, պրիմերի նախագծման սկզբունքների, ROX-ի ընտրության, ռեակցիայի համակարգի կազմաձևման և ռեակցիայի պայմանների կարգավորումից և այլնի ընտրությունից:

Քանակական մեթոդների ընտրություն.

Քանակական մեթոդները բաժանվում են հարաբերական քանակական և բացարձակ քանակական մեթոդների։Հարաբերական քանակականացումը կարող է օգտագործվել որոշ բուժման մեթոդների ազդեցությունը գեների արտահայտման վրա հայտնաբերելու, տարբեր ժամանակներում գեների արտահայտման տարբերությունը հայտնաբերելու և տարբեր հյուսվածքներում գեների արտահայտման տարբերությունը համեմատելու համար:Բացարձակ քանակականացումը կարող է հայտնաբերել նուկլեինաթթվի քանակությունը վիրուսում և այլն։Փորձեր կատարելիս մենք պետք է ընտրենք համապատասխան քանակական մեթոդներ՝ ըստ մեր փորձերի։

Այբբենարանի նախագծման սկզբունքները.

qPCR-ի համար այբբենարանի ձևավորումն ուղղակիորեն կապված է ուժեղացման արդյունավետության և արտադրանքի առանձնահատկությունների հետ:Հետևաբար, լավ պրայմերների ճիշտ ձևավորումը հաջող qPCR-ի առաջին քայլն է:Պրայմերների նախագծման ժամանակ պետք է ուշադրություն դարձնել հետևյալ սկզբունքներին, երբ համապատասխանում է այբբենարանի սովորական ձևավորման սկզբունքին.

1. Թիրախի բեկորի երկարությունը վերահսկվում է 100-ից 300 բ/պ;

2. Խաչաձև էկզոնային ձևավորում՝ գենոմային ԴՆԹ-ի ազդեցությունից խուսափելու համար;

3. Նախագծված պրայմերները պետք է փորձարկվեն ուժեղացման արդյունավետության համար, և միայն այն դեպքում, երբ ուժեղացման արդյունավետությունը հասնի ստանդարտին (90-110%), դրանք կարող են օգտագործվել քանակական փորձերի համար;

4. Այբբենարանի կոնցենտրացիան սովորաբար օպտիմիզացված է 0,1 մՄ-ից 1,0 մՄ միջակայքում:

ԸնտրությունROX:

Քանակական ռեակցիայի գործընթացում ROX-ը կարող է միատեսակ կարգավորել օպտիկական ուղու տարբերությունը, պիպերտավորման սխալը կամ գոլորշիացման և խտացման հետևանքով առաջացած ծավալի տարբերությունը` բարելավելով արդյունքների կրկնելիությունը:Այնուամենայնիվ, պետք է նշել, որ ROX-ի ընտրությունը կապված է գործիքի հետ։Եթե ​​qPCR գործիքն ունի անցքերի միջև տարբերությունը ավտոմատ կերպով շտկելու գործառույթ, ապա այն պետք չէ ավելացնել ROX;հակառակ դեպքում, անհրաժեշտ է ավելացնել ROX ուղղումը:Ռեակտիվներ գնելու փոքր գործընկերները պետք է համապատասխանեն այն գործիքին, որն օգտագործվում է ճիշտ ROX ընտրելու համար, խուսափել հետագա սխալներից:

Ռեակցիայի համակարգի պատրաստում.

Նախընտրելի են ռեակցիայի 20ուլ և 50ուլլ ծավալները:Համակարգը ձևակերպելիս պետք է ուշադրություն դարձնել հետևյալ հարցերին.

1. Ռեակցիայի համակարգը պետք է պատրաստվի օդափոխությամբ գերմաքուր աշխատասենյակում, նոր ddH₂O օգտագործվում է յուրաքանչյուր փորձի համար;

2. Յուրաքանչյուր փորձ պետք է նախապատրաստի NTC՝ ստուգելու, թե արդյոք համակարգում աղտոտվածություն կա, և յուրաքանչյուր զույգ այբբենարան պետք է անի NTC համակարգը պատրաստելիս;

3. ՌՆԹ ձևանմուշում gDNA մնացորդ կա՞ պարզելու համար, NRT կարելի է պատրաստել յուրաքանչյուր նմուշի համար՝ հայտնաբերման համար.

4. Համակարգը պատրաստելիս խորհուրդ է տրվում մեկ նմուշի համար կատարել առնվազն 3 տեխնիկական կրկնություն;

5. Երբ ձևանմուշը cDNA է, խորհուրդ է տրվում նոսրացնել 5-10 անգամ՝ qPCR փորձի վրա հակադարձ արտագրման համակարգի արգելակման ազդեցությունը նվազեցնելու համար:Կաղապարի քանակն ավելի լավ է ուսումնասիրել ըստ գրադիենտի, որպեսզի CT արժեքը ընկնի 20-30-ի միջև;

6. Որոշել ռեակցիաների պահանջվող թիվը, ռեակցիաների քանակից ելնելով ավելացնել 5-10%-ով և հաշվարկել ծավալային կոնֆիգուրացիայի թիվը;

7, համակարգը պատրաստվում է օգտագործելով պրեմիքս սկզբունքը, խառնելով ցենտրիֆուգումից հետո և ապահովելով փուչիկների բացակայություն;

8, Որքան հնարավոր է ընտրել օժանդակ սպառվող նյութեր:

Առնչվող RT-qPCR հավաքածու