Հայտնի է, որ կենտրոնական դոգմայում ՌՆԹ-ն տրանսկրիպցիոն միջնորդն է ԴՆԹ-ի և սպիտակուցի արտահայտման միջև:ԴՆԹ-ի հայտնաբերման համեմատությամբ, ՌՆԹ-ի հայտնաբերումը կարող է ավելի օբյեկտիվորեն արտացոլել օրգանիզմների գենային արտահայտությունը:ՌՆԹ-ի հետ կապված փորձերը ներառում են. qRT-PCR, RNA-Seq և միաձուլված գենի հայտնաբերում և այլն: Հիմք ընդունելով ՌՆԹ-ի բնութագրերը (ՌՆԹ-ի շաքարային օղակն ունի մեկ ավելի ազատ հիդրոքսիլ խումբ, քան ԴՆԹ-ի շաքարային օղակը), զուգորդված շրջակա միջավայրում մեծ քանակությամբ RNase-ների հետ, ՌՆԹ-ն ավելի անկայուն է և ավելի հեշտ է քայքայվել, քան ԴՆԹ-ն:Աղբը ներս է մտնում, աղբը դուրս է հանվում, եթե ՌՆԹ-ի որակը լավ չէ, ապա փորձարարական արդյունքները պետք է լինեն անբավարար, մասնավորապես դրսևորվեն որպես ոչ ճշգրիտ տվյալներ կամ վատ կրկնելիություն:Հետևաբար, ավելի մեծ ուշադրություն պետք է դարձնել ՌՆԹ-ի մշակմանը, և որակի վերահսկման կապը նույնպես ավելի կարևոր է հետագա փորձարարական տվյալների ճշգրտությունն ու ճշգրտությունն ապահովելու համար:

ՌՆԹ-ի որակի վերահսկման համար սովորաբար օգտագործվում են հետևյալ սովորաբար օգտագործվող մեթոդները.

• Սպեկտրոֆոտոմետրիա
• ագարոզայի գել էլեկտրոֆորեզ
• Agilent Bioanalyzer
• իրական ժամանակի լյումինեսցենտային քանակական PCR
• Կուբիտ լյումինեսցենտային ներկման մեթոդ

01 Սպեկտրոֆոտոմետրիա

ՌՆԹ-ն ունի զուգակցված կրկնակի կապեր և ունի կլանման գագաթնակետ 260 նմ ալիքի երկարությամբ:Համաձայն Լամբերտ-Բիրի օրենքի՝ մենք կարող ենք հաշվարկել ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան կլանման գագաթնակետից 260 նմ:Բացի այդ, մենք կարող ենք նաև հաշվարկել ՌՆԹ-ի մաքրությունը՝ ըստ 260 նմ, 280 նմ և 230 նմ կլանման գագաթների հարաբերակցության։280 նմ և 230 նմ սպիտակուցների և փոքր մոլեկուլների կլանման գագաթները համապատասխանաբար:Որակյալ ՌՆԹ-ի մաքրության A260/A280 և A260/A230 հարաբերակցությունը պետք է լինի 2-ից մեծ: Եթե այն 2-ից պակաս է, նշանակում է, որ ՌՆԹ-ի նմուշում կա սպիտակուց կամ փոքր մոլեկուլային աղտոտվածություն և պետք է նորից մաքրվի:Աղտոտման աղբյուրները կազդեն ներքևում գտնվող փորձերի վրա, ինչպիսիք են PCR ռեակցիաների ուժեղացման արդյունավետության արգելակումը, ինչը կհանգեցնի ոչ ճշգրիտ քանակական արդյունքների:ՌՆԹ-ի մաքրությունը մեծ ազդեցություն ունի հետագա արդյունքների վրա, ուստի սպեկտրոֆոտոմետրիան ընդհանուր առմամբ որակի վերահսկման անփոխարինելի օղակ է նուկլեինաթթուների փորձարկումների առաջին փուլում:

Նկար 1. Տիպիկ ՌՆԹ/ԴՆԹ կլանման սպեկտր

02 Ագարոզա գել էլեկտրոֆորեզ

Բացի մաքրությունից, ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը նաև ՌՆԹ-ի որակի վերաբերյալ կարևոր ցուցիչներից է։ՌՆԹ-ի քայքայումը կհանգեցնի նմուշում մեծ թվով կարճ բեկորների, ուստի ՌՆԹ-ի բեկորների թիվը, որոնք կարող են արդյունավետ կերպով հայտնաբերվել և ծածկվել հղման հաջորդականությամբ, կկրճատվի:ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը կարելի է ստուգել ընդհանուր ՌՆԹ-ի էլեկտրոֆորեզով 1% ագարոզայի գելի վրա:Այս մեթոդը կարող է ինքնուրույն կարգավորել գելը կամ օգտագործել հավաքովի E-Gel™ համակարգը ամբողջականության փորձարկման համար:Ընդհանուր ՌՆԹ-ի ավելի քան 80%-ը կազմում է ռիբոսոմային ՌՆԹ-ն, որի մեծ մասը կազմված է 28S և 18S rRNA-ից (կաթնասունների համակարգերում)։Լավ որակի ՌՆԹ-ն ցույց կտա երկու ակնհայտ վառ գծեր, որոնք համապատասխանաբար 28S և 18S վառ գծեր են՝ 5 Կբ և 2 Կբ, և հարաբերակցությունը հակված կլինի մոտ 2:1:Եթե ​​այն ցրված վիճակում է, դա նշանակում է, որ ՌՆԹ-ի նմուշը կարող է քայքայվել, և խորհուրդ է տրվում օգտագործել ավելի ուշ նկարագրված մեթոդը՝ ՌՆԹ-ի որակը հետագա ստուգելու համար:

Նկար 2. Քայքայված (երթուղի 2) և անձեռնմխելի ՌՆԹ-ի (երթուղի 3) համեմատությունը ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզի վրա

03 Agilent Bioanalyzer

Ի հավելումն վերը նկարագրված ագարոզայի գելի էլեկտրոֆորեզի մեթոդի, որը կարող է օգնել մեզ պարզ և արագ պարզել ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը, մենք կարող ենք նաև օգտագործել Agilent բիոանալիզատորը՝ ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը որոշելու համար:ՌՆԹ-ի կոնցենտրացիան և ամբողջականությունը գնահատելու համար այն օգտագործում է միկրոհեղուկների, մազանոթային էլեկտրոֆորեզի և ֆլյուորեսցենտների համադրություն:Օգտագործելով ներկառուցված ալգորիթմը ՌՆԹ-ի նմուշի պրոֆիլը վերլուծելու համար, Agilent բիոանալիզատորը կարող է հաշվարկել տեղեկատու ՌՆԹ-ի ամբողջականության արժեքը՝ ՌՆԹ ամբողջականության համարը (այսուհետ՝ RIN) [1]:Որքան մեծ է RIN-ի արժեքը, այնքան բարձր է ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը (1-ը ծայրահեղ դեգրադացված է, 10-ը՝ առավել ամբողջական):ՌՆԹ-ի հետ կապված որոշ փորձեր առաջարկում են օգտագործել RIN-ը որպես որակի գնահատման պարամետր:Որպես օրինակ վերցնելով հաջորդականության բարձր թողունակության փորձերը (այսուհետ՝ NGS), Oncomine™ Human Immune Repertoire-ի ուղեցույցները, որոնք օգտագործվում են Thermo Fisher's Oncomine վահանակի շարքում B բջիջների և T բջիջների հակագենային ընկալիչների հայտնաբերման համար, առաջարկում են, որ RIN արժեքներով նմուշները կարող են ավելի քան 4-ից բարձր լինել (4-ից ավելի արդյունավետ չափումներ):Կան տարբեր առաջարկվող միջակայքեր տարբեր վահանակների համար, և հաճախ ավելի բարձր RIN-ը կարող է բերել ավելի արդյունավետ տվյալներ:

Նկար 3, Oncomine™ մարդու իմունային ռեպերտուարի փորձերում, 4-ից ավելի RIN ունեցող նմուշները կարող են հայտնաբերել ավելի արդյունավետ ընթերցումներ և T բջջային կլոններ:【2】

Այնուամենայնիվ, RIN արժեքը նույնպես ունի որոշ սահմանափակումներ:Չնայած RIN-ը բարձր հարաբերակցություն ունի NGS փորձարարական տվյալների որակի հետ, այն հարմար չէ FFPE նմուշների համար:FFPE նմուշները քիմիապես մշակվել են երկար ժամանակ, և արդյունահանված ՌՆԹ-ն ընդհանուր առմամբ ունի համեմատաբար ցածր RIN արժեք:Սակայն դա չի նշանակում, որ փորձի արդյունավետ տվյալները պետք է անբավարար լինեն։FFPE նմուշների որակը ճշգրիտ գնահատելու համար մենք պետք է օգտագործենք այլ չափումներ, բացի RIN-ից:Բացի RIN-ից, Agilent բիոանալիզատորը կարող է նաև հաշվարկել DV200 արժեքը՝ որպես ՌՆԹ որակի գնահատման պարամետր:DV200-ը պարամետր է, որը հաշվարկում է 200 bp-ից մեծ բեկորների համամասնությունը ՌՆԹ-ի նմուշում:DV200-ը FFPE նմուշի որակի ավելի լավ ցուցանիշ է, քան RIN-ը:FFPE-ի կողմից արդյունահանվող ՌՆԹ-ի համար այն շատ բարձր հարաբերակցություն ունի արդյունավետ կերպով հայտնաբերվող գեների քանակի և գեների բազմազանության հետ [3]:Չնայած DV200-ը կարող է լրացնել FFPE-ի որակի հայտնաբերման թերությունները, Agilent բիոանալիզատորը դեռևս չի կարող համակողմանիորեն վերլուծել ՌՆԹ-ի նմուշների որակի խնդիրները, ներառյալ՝ արդյոք նմուշներում կան արգելիչներ:Ինհիբիտորներն իրենք կարող են ազդել ներքևում գտնվող փորձերի ուժեղացման արդյունավետության վրա և նվազեցնել օգտակար տվյալների քանակը:Որպեսզի իմանանք, թե արդյոք նմուշում կա արգելակիչ, մենք կարող ենք կիրառել իրական ժամանակի լյումինեսցենտ քանակական PCR մեթոդը, որը նկարագրված է հաջորդիվ:

04 իրական ժամանակի լյումինեսցենտային քանակական PCR

Իրական ժամանակի ֆլուորեսցենտային քանակական PCR մեթոդը կարող է ոչ միայն հայտնաբերել նմուշի ինհիբիտորները, այլև ճշգրիտ կերպով արտացոլել FFPE նմուշի ՌՆԹ-ի որակը:Համեմատած Agilent կենսաբանական անալիզատորների հետ, իրական ժամանակի ֆլուորեսցենտային քանակական գործիքներն ավելի տարածված են հիմնական կենսաբանական լաբորատորիաներում՝ իրենց ավելի լայն կիրառման շնորհիվ:ՌՆԹ-ի նմուշների որակը ստուգելու համար մենք միայն պետք է գնենք կամ պատրաստենք այբբենարանային զոնդեր ներքին տեղեկատու գեների համար, ինչպիսին է GUSB-ը (Cat No. Hs00939627):Օգտագործելով այբբենարանների, զոնդերի և ստանդարտների այս հավաքածուն (հայտնի կոնցենտրացիայի ընդհանուր ՌՆԹ)՝ բացարձակ քանակական փորձեր անցկացնելու համար, ՌՆԹ-ի բեկորների արդյունավետ կոնցենտրացիան կարող է հաշվարկվել որպես ՌՆԹ որակի գնահատման ստանդարտ (կարճ՝ «Functional RNA Quantitation» (FRQ)):NGS թեստում մենք պարզեցինք, որ ՌՆԹ-ի նմուշների FRQ-ն շատ բարձր հարաբերակցություն ունի արդյունավետ տվյալների ծավալի հետ:0,2 նգ/ուլլ FRQ-ից ավելի բոլոր նմուշների դեպքում ընթերցումների առնվազն 70%-ը կարող է արդյունավետ կերպով ծածկել հղման հաջորդականությունը (Նկար 4):

Նկար 4, ֆլուորեսցենտային քանակական մեթոդով հայտնաբերված FRQ արժեքը շատ բարձր հարաբերակցություն ունի (R2>0.9) NGS փորձարկումից ստացված արդյունավետ տվյալների հետ:Կարմիր գիծը FRQ արժեքն է, որը հավասար է 0,2 նգ/ուլլ (log10 = -0,7):【4】

Բացի FFPE նմուշների համար կիրառելի լինելուց, իրական ժամանակի քանակական PCR մեթոդը կարող է նաև արդյունավետ կերպով վերահսկել նմուշների արգելակիչները:Մենք կարող ենք հայտնաբերման ենթակա նմուշը ավելացնել ներքին դրական հսկողության (IPC) և դրա վերլուծության միջոցով ռեակցիայի համակարգում, այնուհետև կատարել ֆլյուորեսցենտային քանակականացում՝ Ct արժեքը ստանալու համար:Եթե ​​Ct արժեքը հետ է մնում Ct արժեքից առանց նմուշառման ռեակցիայի մեջ, դա ցույց է տալիս, որ արգելիչն առկա է նմուշում և արգելակում է ռեակցիայի ուժեղացման արդյունավետությունը:

05 Կուբիտ լյումինեսցենտային ներկերի մեթոդ

Qubit Fluorometer-ը նուկլեինաթթվի կոնցենտրացիայի և մաքրության հայտնաբերման համար ամենից հաճախ օգտագործվող փոքր սարքն է, որը հեշտ է գործել և գոյություն ունի գրեթե բոլոր մոլեկուլային կենսաբանության լաբորատորիայում:Այն ճշգրիտ հաշվարկում է նուկլեինաթթվի կոնցենտրացիան՝ հայտնաբերելով և նուկլեինաթթուն կապող ֆլուորեսցենտային ներկը (Qubit հայտնաբերման ռեագենտ):Qubit-ն ունի բարձր զգայունություն և յուրահատկություն և կարող է ճշգրիտ չափել ՌՆԹ-ն մինչև pg/µL կոնցենտրացիան:Ի լրումն նուկլեինաթթվի կոնցենտրացիայի ճշգրիտ քանակականացման հայտնի կարողության, Thermo Fisher-ի վերջին նոր մոդելը՝ Qubit 4.0-ը, կարող է նաև հայտնաբերել ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը:Qubit 4.0-ի ՌՆԹ-ի հայտնաբերման համակարգը (RNA IQ Assay) հայտնաբերում է ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը՝ միաժամանակ հայտնաբերելով երկու հատուկ լյումինեսցենտ ներկեր:Այս երկու լյումինեսցենտային ներկերը կարող են համապատասխանաբար կապվել ՌՆԹ-ի մեծ բեկորների և փոքր բեկորների հետ:Այս երկու լյումինեսցենտային ներկերը ցույց են տալիս նմուշում ՌՆԹ-ի մեծ բեկորների համամասնությունը, և դրանից կարելի է հաշվարկել ՌՆԹ-ի որակը ներկայացնող IQ (Ամբողջականություն և որակ) արժեքը:IQ արժեքը կիրառելի է ինչպես FFPE, այնպես էլ ոչ FFPE նմուշների համար և մեծ ազդեցություն ունի հաջորդական հաջորդականության որակի վրա:Որպես օրինակ վերցնելով NGS փորձերը, Ion torrent™ հարթակի վրա իրականացված RNA-Seq թեստային փորձերում, 4-ից բարձր IQ արժեքներով նմուշների մեծ մասը ունեցել է առնվազն 50% արդյունավետ ընթերցումներ (Նկար 5):Համեմատած վերոհիշյալ հայտնաբերման մեթոդների հետ՝ Qubit IQ Assay-ը ոչ միայն ավելի հարմար է գործել և ավելի քիչ ժամանակ է պահանջում (հինգ րոպեի ընթացքում), այլև մեծ հարաբերակցություն ունի չափված պարամետրի IQ արժեքի և ներքևում գտնվող փորձերի տվյալների որակի միջև:

Նկար 5, կա մեծ հարաբերակցություն Qubit RNA IQ արժեքի և RNA-Seq-ի քարտեզագրված ընթերցումների միջև:【5】

Վերոհիշյալ ներածության միջոցով ես կարծում եմ, որ բոլորը բավարար պատկերացում ունեն ՌՆԹ-ի որակի վերահսկման տարբեր մեթոդների մասին:Գործնականում դուք կարող եք ընտրելհամապատասխան մեթոդը՝ ըստ նմուշի տեսակի և առկա գործիքների:Միայն ՌՆԹ-ի որակը լավ վերահսկելու դեպքում մենք կարող ենք խուսափել հետագա փորձերի ձախողումից, որը պայմանավորված է նմուշի վատ որակով, այդպիսով խնայելով թանկարժեք ժամանակը, էներգիան և ծախսերը:

Հղում արտադրանք.

Կենդանիների ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու

Բջջի ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու

հղումներ

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN. ՌՆԹ-ի ամբողջականության համարը ՌՆԹ-ի չափումներին ամբողջականության արժեքներ վերագրելու համար:BMC Molecular Biol 7, 3 (2006):https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire Օգտագործողի ուղեցույց (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0):

【3】Լեա Ս Ուեհմաս, Չարլզ Է Վուդ, Բրայան Ն Չորլի, Քերոլ Լ Յաուկ, Գեյլ Մ Նելսոն, Սյուզան Դ Հեսթեր, Արխիվային ֆորմալինի ֆիքսված պարաֆինով ներկառուցված հյուսվածքների նմուշներից ստացված ՌՆԹ-ի գնահատման ընդլայնված որակի չափումներ 2, Օգոստոս 2, Թունաբանական գիտություններ 17, 57–373 թթ.https://doi.org/10.1093/toxsci/