Պիպետտի ծայրերի և EP խողովակների ստերիլիզացում և այլն:

1. Պատրաստեք 0,1% (մեկ հազարերորդական) DEPC (բարձր թունավոր նյութ) դեիոնացված ջրով, զգուշորեն օգտագործեք գոլորշի սարքի մեջ և պահեք այն 4°C ջերմաստիճանում լույսից հեռու;

DEPC ջուրը մաքուր ջուր է, որը մշակվում է DEPC-ով և մանրէազերծվում բարձր ջերմաստիճանով և բարձր ճնշումով:Փորձարկվել է RNase-ից, DNase-ից և պրոտեինազից զերծ լինելու համար:

2. Պիպետտի ծայրը և EP խողովակը դրեք 0,1% DEPC-ի մեջ և համոզվեք, որ պիպետտի ծայրը և EP խողովակը լցված են 0,1% DEP-ով:

3. Պաշտպանեք լույսից, թողեք մնա, գիշերը (12-24ժ)

4. Ծայրը և EP խողովակը պարունակող տուփը կարիք չունի թրջելու DEPC-ով:DEPC ջուրը ծայրի կամ EP խողովակի մեջ կոպտորեն հեռացնելուց հետո փաթեթավորեք այն և փաթաթեք այն:

5. 121 աստիճան Celsius, 30min

6. 180 աստիճան Ցելսիուս, չոր մի քանի ժամ (առնվազն 3 ժամ)

Ծանոթագրություն՝ ա.DEPC-ի հետ աշխատելիս կրեք լատեքսային ձեռնոցներ և դիմակներ:բ, կամ առանց DEPC ստերիլիզացման, 130 ℃, 90 րոպե ավտոկլավ (շատ լաբորատորիաների բարձր ջերմաստիճանի ստերիլիզացում երկու անգամ)

ՌՆԹ արդյունահանման նկատառումներ

Հյուսվածքային ՌՆԹ-ի մեկուսացման ձախողման երկու հիմնական երևույթ

ՌՆԹ-ի քայքայումը և հյուսվածքներում կեղտերի մնացորդները,Ինչ վերաբերում է քայքայմանը, նախ տեսնենք, թե ինչու մշակված բջիջներից արդյունահանվող ՌՆԹ-ն հեշտությամբ չի քայքայվում:Գոյություն ունեցող ՌՆԹ արդյունահանման ռեակտիվները բոլորը պարունակում են բաղադրիչներ, որոնք արագորեն արգելակում են RNase-ը:Ավելացրեք լիզատը աճեցված բջիջներին և պարզապես խառնեք այն, բոլոր բջիջները կարող են մանրակրկիտ խառնվել լիզատի հետ, և բջիջներն ամբողջությամբ լուծվում են:Բջիջների լիզումից հետո լիզատի ակտիվ բաղադրիչները անմիջապես արգելակում են ներբջջային RNase-ը, ուստի ՌՆԹ-ն մնում է անձեռնմխելի:Այսինքն, քանի որ մշակված բջիջները հեշտությամբ և ամբողջությամբ շփվում են լիզատի հետ, նրանց ՌՆԹ-ն հեշտությամբ չի քայքայվում.Մյուս կողմից, հյուսվածքի ՌՆԹ-ն հեշտությամբ քայքայվում է, քանի որ հյուսվածքի բջիջները հեշտ չէ արագ կապ հաստատել լիզատի հետ:բավարար շփման պատճառով:Այսպիսով,Եթե ​​ենթադրենք, որ կա հյուսվածքը մեկ բջջի վերածելու միջոց՝ միաժամանակ արգելելով ՌՆԹ-ի ակտիվությունը, ապա դեգրադացիայի խնդիրը կարող է ամբողջությամբ լուծվել:

Հեղուկ ազոտի ֆրազը նման ամենաարդյունավետ մեթոդն է:Այնուամենայնիվ, հեղուկ ազոտի ֆրեզերային մեթոդը շատ անհանգիստ է, հատկապես, երբ նմուշների քանակը մեծ է:Սա հանգեցրեց հաջորդ լավագույն բանին. համասեռացուցիչը:Այնհոմոգենիզատորմեթոդը չի հաշվի առնում այն ​​հարցը, թե ինչպես է RNase-ի ակտիվությունը արգելակվում նախքան բջիջների շփումը լիզատի հետ, այլ ավելի շուտ աղոթում է, որ հյուսվածքների խզման արագությունը լինի ավելի արագ, քան այն արագությունը, որով ներբջջային RNase-ը քայքայում է RN-ը:

Էլեկտրական հոմոգենիզատորի ազդեցությունն ավելի լավ է,իսկ ապակու հոմոգենիզատորի ազդեցությունը թույլ է, բայց ընդհանուր առմամբ, հոմոգենիզատորի մեթոդը չի կարող կանխել դեգրադացիայի երևույթը:Հետևաբար, եթե արդյունահանումը քայքայված է, ապա սկզբնական էլեկտրական հոմոգենիզատորը պետք է օգտագործվի հեղուկ ազոտով մանրացնելու համար.օրիգինալ ապակու հոմոգենիզատորը պետք է փոխվի էլեկտրական հոմոգենիզատորի կամ ուղղակիորեն աղացվի հեղուկ ազոտով:Խնդիրը գրեթե 100%-ով իրականանալի է։լուծվել.

Հետագա փորձերի վրա ազդող անմաքրության մնացորդի խնդիրը ավելի բազմազան պատճառներ ունի, քան քայքայումը, և լուծումները համապատասխանաբար տարբեր են:Եզրափակելով.եթե հյուսվածքում դեգրադացիա կամ մնացորդային կեղտեր կան, ապա կոնկրետ փորձարարական նյութի արդյունահանման մեթոդը/ռեակտիվը պետք է օպտիմալացվի:Օպտիմալացման համար պետք չէ օգտագործել ձեր թանկարժեք նմուշները. շուկայից կարող եք գնել որոշ մանր կենդանիներ, օրինակ՝ ձուկ/հավ, վերցնել նյութի համապատասխան մասը ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար, իսկ մյուս մասը՝ սպիտակուցի արդյունահանման համար՝ մանրացնել բերանով, ստամոքսով և աղիքներով:

Արդյունահանված ՌՆԹ-ի թիրախային ՌՆԹ-ն օգտագործվում է տարբեր հետագա փորձերի համար, և դրա որակի պահանջները տարբեր են

cDNA գրադարանի կառուցումը պահանջում է ՌՆԹ ամբողջականություն՝ առանց ֆերմենտային ռեակցիայի ինհիբիտորների մնացորդների;Հյուսիսային պահանջում է ավելի բարձր ՌՆԹ ամբողջականություն և ավելի ցածր պահանջներ ֆերմենտային ռեակցիայի ինհիբիտորների մնացորդների համար;RT-PCR-ն չի պահանջում շատ բարձր ՌՆԹ ամբողջականություն,բայց արգելակում է ֆերմենտային ռեակցիաները:Մնացորդների պահանջները խիստ են.Մուտքը որոշում է ելքը.Ամեն անգամ, երբ նպատակը ամենաբարձր մաքրության ՌՆԹ-ն է, դա կարժենա մարդկանց և փող:

Նմուշների հավաքում/պահպանում

Քայքայման վրա ազդող գործոններ Այն բանից հետո, երբ նմուշը լքում է կենդանի մարմինը/կամ աճի սկզբնական միջավայրը, նմուշի էնդոգեն ֆերմենտները կսկսեն քայքայել ՌՆԹ-ն,իսկ քայքայման արագությունը կապված է էնդոգեն ֆերմենտների պարունակության և ջերմաստիճանի հետ։Ավանդաբար, էնդոգեն ֆերմենտի ակտիվությունը ամբողջությամբ արգելակելու միայն երկու եղանակ կա. անմիջապես ավելացնել լիզատը և մանրակրկիտ և արագ միատարրացնել;կտրատել փոքր կտորներով և անմիջապես սառեցնել հեղուկ ազոտի մեջ։Երկու մոտեցումներն էլ պահանջում են արագ գործողություն:Վերջինը հարմար է բոլոր նմուշների համար, մինչդեռ առաջինը հարմար է միայն բջիջների և էնդոգեն ֆերմենտների ցածր պարունակությամբ և ավելի հեշտ համասեռացման հյուսվածքների համար:Մասնավորապես, բուսական հյուսվածքը, լյարդը, տիմուսը, ենթաստամոքսային գեղձը, փայծաղը, ուղեղը, ճարպը, մկանային հյուսվածքը և այլն ավելի լավ է սառեցնել հեղուկ ազոտով նախքան շարունակելը:

Նմուշների մասնատում և համասեռացում

Դեգրադացիայի և եկամտաբերության վրա ազդող գործոններ Նմուշի մասնատումն էմանրակրկիտ համասեռացման համար, որը նախատեսված է ՌՆԹ-ի ամբողջական և ամբողջական ազատման համար։Բջիջները կարող են ուղղակիորեն համասեռացվել առանց կոտրվելու:Հյուսվածքները կարելի է համասեռացնել միայն կոտրվելուց հետո։Խմորիչները և բակտերիաները պետք է ջարդվեն համապատասխան ֆերմենտներով, նախքան դրանք միատարրացվելը:Էնդոգեն ֆերմենտների ավելի ցածր պարունակությամբ և ավելի հեշտ համասեռացում ունեցող հյուսվածքները կարող են միանգամայն մանրացնել և համասեռացվել լիզատի մեջ հոմոգենիզատորի միջոցով.բուսական հյուսվածք, լյարդ, տիմուս, ենթաստամոքսային գեղձ, փայծաղ, ուղեղ, ճարպ, մկանային հյուսվածք և այլ նմուշներ, դրանք կա՛մ բարձր են էնդոգեն ֆերմենտներով, կա՛մ հեշտությամբ չեն համասեռացվում,ուստի հյուսվածքների խանգարումը և համասեռացումը պետք է իրականացվեն առանձին.Մանրացման ամենահուսալի և արդյունավետ մեթոդը հեղուկ ազոտով ֆրեզումն է, իսկ համասեռացման ամենահուսալի մեթոդը՝ էլեկտրական հոմոգենիզատորի օգտագործումը։Հեղուկ ազոտով ֆրեզման մասին հատուկ նշում. նմուշը չպետք է հալվի ամբողջ ֆրեզերային գործընթացի ընթացքում, քանի որ սառեցման ժամանակ էնդոգեն ֆերմենտները ավելի հավանական է գործելու:

Լիզատի ընտրություն

Գործողության հարմարավետության և մնացորդային էնդոգեն կեղտերի գործոնների վրա ազդող Լիզայի լուծույթները կարող են գրեթե արգելակել RNase-ի ակտիվությունը:Հետևաբար, լիզի լուծույթի ընտրության հիմնական կետը մաքրման մեթոդի հետ համատեղ դիտարկելն է:Մեկ բացառություն կա.Էնդոգեն ֆերմենտների բարձր պարունակությամբ նմուշներին խորհուրդ է տրվում օգտագործել ֆենոլ պարունակող լիզատ՝ էնդոգեն ֆերմենտներն ապաակտիվացնելու ունակությունը բարձրացնելու համար:

Մաքրման մեթոդի ընտրություն

Գործոններ, որոնք ազդում են մնացորդային էնդոգեն կեղտերի վրա, արդյունահանման արագություն Մաքուր նմուշների համար, ինչպիսիք են բջիջները, բավարար արդյունքներ կարելի է ստանալ ձեռքի տակ գտնվող գրեթե ցանկացած մաքրման մեթոդով:Բայց շատ այլ նմուշների համար, հատկապես այնպիսի նմուշների համար, որոնք ունեն բարձր մակարդակի կեղտեր, ինչպիսիք են բույսերը, լյարդը, բակտերիաները և այլն, մաքրման հարմար մեթոդ ընտրելը շատ կարևոր է:Սյունակի կենտրոնախույս մաքրման մեթոդն ունի արդյունահանման արագ արագություն և կարող է արդյունավետորեն հեռացնել կեղտերը, որոնք ազդում են ՌՆԹ-ի հետագա ֆերմենտային ռեակցիայի վրա, բայց դա թանկ է (Foregene-ը կարող է առաջարկել ծախսարդյունավետ փաթեթներ, ավելի մանրամասն սեղմեքայստեղ);օգտագործելով տնտեսական և դասական մաքրման մեթոդները, ինչպիսիք են LiCl տեղումները, նույնպես կարող են բավարար արդյունքներ ստանալ, սակայն շահագործման ժամանակը երկար է:.

«Երեք դիսցիպլիններ և ութ ուշադրություն» ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար

Կարգապահություն 1:Վերջ տվեք էկզոգեն ֆերմենտների աղտոտմանը:

Ծանոթագրություն 1:Խստորեն կրեք դիմակներ և ձեռնոցներ։

Ծանոթագրություն 2:Ցենտրիֆուգային խողովակները, ծայրի գլխիկները, պիպետների ձողերը, էլեկտրոֆորեզի տանկերը և փորձարարական նստարանները, որոնք ներգրավված են փորձի մեջ, պետք է մանրակրկիտ հեռացվեն:

Ծանոթագրություն 3:Փորձի մեջ ներգրավված ռեակտիվները/լուծույթները, հատկապես ջուրը, պետք է լինեն առանց RNase-ի:

Կարգապահություն 2:Արգելափակել էնդոգեն ֆերմենտների ակտիվությունը

Ծանոթագրություն 4:Ընտրեք համապատասխան համասեռացման մեթոդ:

Ծանոթագրություն 5:Ընտրեք համապատասխան լիզատ:

Ծանոթագրություն 6:Վերահսկեք նմուշի մեկնարկային քանակը:

Կարգապահություն 3:Հստակեցրեք ձեր արդյունահանման նպատակը

Ծանոթագրություն 7:Լիզատի ցանկացած համակարգի դեպքում, որը մոտենում է նմուշի առավելագույն սկզբնական քանակին, արդյունահանման հաջողության մակարդակը կտրուկ նվազում է:

Ծանոթագրություն 8:ՌՆԹ-ի հաջող արդյունահանման միակ տնտեսական չափանիշը հետագա փորձերում հաջողությունն է, այլ ոչ թե արդյունքը:

RNase աղտոտման 10 լավագույն աղբյուրները

1. Մատները էկզոգեն ֆերմենտների առաջին աղբյուրն են, ուստի ձեռնոցները պետք է հաճախակի կրել և փոխարինել:Բացի այդ, պետք է նաև դիմակներ կրել, քանի որ շնչառությունը նույնպես ֆերմենտների կարևոր աղբյուր է։Ձեռնոցային դիմակ կրելու լրացուցիչ առավելությունը փորձարարին պաշտպանելն է:

2. Պիպետտի ծայրեր, ցենտրիֆուգային խողովակներ, պիպետներ – RNase-ը չի կարող ապաակտիվացվել միայն ստերիլիզացման միջոցով, ուստի խողովակների ծայրերը և ցենտրիֆուգային խողովակները պետք է մշակվեն DEPC-ով, նույնիսկ եթե դրանք նշված են որպես DEPC մշակված:Լավագույնն է օգտագործել հատուկ նշանակության պիպետտ, օգտագործելուց առաջ այն սրբել 75% ալկոհոլային բամբակով, հատկապես ձողը;Բացի այդ, համոզվեք, որ գլխի հեռացման միջոց չօգտագործեք:

3. Ջուրը/բուֆերը պետք է զերծ լինի RNase աղտոտվածությունից:

4. Առնվազն փորձարկման սեղանը պետք է մաքրել 75% ալկոհոլային բամբակյա գնդիկներով:

5. Էնդոգեն RNase Բոլոր հյուսվածքները պարունակում են էնդոգեն ֆերմենտներ, ուստի հյուսվածքների արագ սառեցումը հեղուկ ազոտով դեգրադացիան նվազեցնելու լավագույն միջոցն է:Հեղուկ ազոտի պահպանման/հղկման մեթոդն իսկապես անհարմար է, բայց այն միակ միջոցն է էնդոգեն ֆերմենտների բարձր մակարդակ ունեցող հյուսվածքների համար:

6. ՌՆԹ նմուշներ ՌՆԹ-ի արդյունահանման արտադրանքը կարող է պարունակել RNase աղտոտման հետքեր:

7. Պլազմիդի արդյունահանում Պլազմիդի արդյունահանումը հաճախ օգտագործում է Rnase՝ ՌՆԹ-ն քայքայելու համար, իսկ մնացորդային Rnase-ը պետք է մարսվի Proteinase K-ով և արդյունահանվի PCI-ով:

8. ՌՆԹ-ի պահպանում Նույնիսկ եթե այն պահվում է ցածր ջերմաստիճանում, RNase-ի հետքային քանակությունները կառաջացնեն ՌՆԹ-ի քայքայումը:ՌՆԹ-ի երկարաժամկետ պահպանման լավագույն լուծումը աղի/ալկոհոլային կասեցումն է, քանի որ ալկոհոլը ցածր ջերմաստիճաններում արգելակում է բոլոր ֆերմենտային ակտիվությունը:

9. Երբ կատիոնները (Ca, Mg) պարունակում են այս իոնները, 80C ջերմաստիճանում 5 րոպե տաքացնելը կհանգեցնի ՌՆԹ-ի ճեղքմանը, հետևաբար, եթե ՌՆԹ-ն պետք է տաքացվի, ապա պահպանման լուծույթը պետք է պարունակի քելացնող նյութ (1մՄ նատրիումի ցիտրատ, pH 6.4):

10. Հետագա փորձերում օգտագործվող ֆերմենտները կարող են աղտոտվել RNase-ով:

10 խորհուրդ ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար

1. Արագ կանխել RNase-ի ակտիվությունը:Նմուշները հավաքելուց հետո արագ սառեցվում են, իսկ RNase-ն ապաակտիվացվում է լիզի ընթացքում արագ գործողության արդյունքում:

2. Ռիբոզիմի բարձր պարունակությամբ հյուսվածքների համար ընտրեք համապատասխան արդյունահանման մեթոդ, իսկ ճարպային հյուսվածքն ավելի լավ է օգտագործել ֆենոլ պարունակող մեթոդը:

3. Կանխատեսման որակը պահանջում է Հյուսիսային, cDNA գրադարանի կառուցումը պահանջում է բարձր ամբողջականություն, իսկ RT-PCR և RPA (Ռիբոնուկլեազի պաշտպանության փորձարկում) չեն պահանջում բարձր ամբողջականություն:RT-PCR-ն պահանջում է բարձր մաքրություն (ֆերմենտի ինհիբիտորների մնացորդներ):

4. Մանրակրկիտ համասեռացումը բերքատվության բարելավման և քայքայման նվազեցման բանալին է:

5. Ստուգեք ՌՆԹ էլեկտրոֆորեզի հայտնաբերման ամբողջականությունը, 28S: 18S = 2: 1-ը ամբողջական նշան է, 1:1-ը նույնպես ընդունելի է փորձերի մեծ մասի համար:

6. ԴՆԹ-ի հեռացում RT-PCR-ի համար, զանգվածային վերլուծություն ԴՆԹ-ն հեռացնելու համար լավագույնն է օգտագործել Dnase I-ը:

7. Նվազեցնել էկզոգեն ֆերմենտների աղտոտվածությունը. ֆերմենտները չեն կարող ներմուծվել դրսից:

8. Ցածր կոնցենտրացիայի նուկլեինաթթու խտացնելիս պետք է ավելացվի համատեղեցման ռեագենտ:Բայց կանխելու ֆերմենտներ պարունակող համակցիչի և ԴՆԹ-ի աղտոտումը:

9. ՌՆԹ-ն մանրակրկիտ լուծարեք, անհրաժեշտության դեպքում տաքացրեք 65C ջերմաստիճանում 5 րոպե:

պահպանման հարմար եղանակ

Կարելի է պահել -20C ջերմաստիճանում կարճ ժամանակ, իսկ -80C ջերմաստիճանում երկար ժամանակ:ՌՆԹ-ի ելքի բարելավման առաջին քայլը գիտակցելն է, որ տարբեր նմուշների ՌՆԹ պարունակությունը մեծապես տարբերվում է:Բարձր առատություն (2-4 մգ/մգ), ինչպիսիք են լյարդը, ենթաստամոքսային գեղձը, սիրտը, միջին առատությունը (0,05-2 մգ/մգ), ինչպիսիք են ուղեղը, սաղմը, երիկամը, թոքերը, տիմուսը, ձվարանները, ցածր առատությունը (<0,05 մգ/մգ) մգ), ինչպիսիք են միզապարկը, ոսկորը, ճարպը:

1. Լիզային բջիջները՝ RN-ի արտազատման համար. եթե ՌՆԹ-ն չի ազատվում, ելքը կնվազի:Էլեկտրական հոմոգենացումն ավելի լավ է աշխատում, քան համասեռացման այլ մեթոդները, բայց կարող է անհրաժեշտ լինել նաև համակցվել այլ մեթոդների հետ, ինչպիսիք են հեղուկ ազոտի տրորումը, ֆերմենտային մարսողությունը (Լիզոզիմ/Լիտիկազ)

2. Արդյունահանման մեթոդի օպտիմալացում:Ֆենոլի վրա հիմնված մեթոդների ամենամեծ խնդիրներն են թերի շերտավորումը և ՌՆԹ-ի մասնակի կորուստը (վերածանցը հնարավոր չէ ամբողջությամբ հեռացնել):Թերի շերտավորումը պայմանավորված է նուկլեինաթթվի և սպիտակուցի բարձր պարունակությամբ, որը կարելի է լուծել՝ ավելացնելով օգտագործվող լիզատի քանակը կամ նվազեցնելով նմուշի քանակը:Քլորոֆորմի արդյունահանման քայլը ավելացվել է ճարպային հյուսվածքին:ՌՆԹ-ի կորուստը կարող է կրճատվել ետ մղելով կամ հեռացնելով օրգանական շերտը, որին հաջորդում է ցենտրիֆուգումը:Սյունակի ցենտրիֆուգացման վրա հիմնված մեթոդների ամենամեծ խնդիրը նմուշի ավելցուկն է:

Դասական արդյունահանման խորհուրդներ

1. Ֆենոլի մաքրում. ավելացրեք հավասար ծավալ 1:1 ֆենոլ/քլորոֆորմ և ակտիվորեն խառնեք 1-2 րոպե:Ցենտրիֆուգեք բարձր արագությամբ 2 րոպե:Զգուշորեն հեռացրեք վերին նյութը (80-90%):Երբեք մի հասեք միջին շերտին:Ռեակցիայի լուծույթի հավասար ծավալը կարող է ավելացվել ֆենոլին/քլորոֆորմին և հեռացնել վերը նշված նյութը:Երկու մակերևույթները կարող են խառնվել իրար՝ նուկլեինաթթվի տեղումների համար՝ բերքատվությունը բարելավելու համար:Մի եղեք շատ նուրբ խառնելիս և մի փորձեք հեռացնել ամբողջ վերին նյութը:

2. Լվացում 70-80% էթանոլով. Լվացքի ընթացքում նուկլեինաթթուն պետք է կասեցվի, որպեսզի ապահովվի, որ աղի մնացորդը լվացվի:Միևնույն ժամանակ, էթանոլը թափելուց անմիջապես հետո մի քանի վայրկյան բարձր արագությամբ ցենտրիֆուգեք, այնուհետև խողովակով հեռացրեք էթանոլի մնացորդը:5-10 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում կանգնելուց հետո լուծեք։

11. Հատուկ կազմակերպությունների արդյունահանում

1. Թելքավոր հյուսվածք. ՌՆԹ-ի արդյունահանման բանալին թելքավոր հյուսվածքից, ինչպիսին է սիրտը/կմախքի մկանները, հյուսվածքն ամբողջությամբ խաթարելն է:Այս հյուսվածքներն ունեն ցածր բջիջների խտություն, ուստի ՌՆԹ-ի քանակը հյուսվածքի մեկ միավորի քաշի համար ցածր է, և լավագույնն է հնարավորինս շատ սկզբնական քանակություն օգտագործել:Համոզվեք, որ հյուսվածքը մանրակրկիտ մանրացրեք սառեցման պայմաններում:

2. Բարձր սպիտակուց/ճարպի պարունակությամբ հյուսվածքներ. ուղեղի/բուսական ճարպի պարունակությունը մեծ է:PCI-ի արդյունահանումից հետո վերին նյութը պարունակում է սպիտակ թաղանթներ:Գերազանց նյութը պետք է նորից արդյունահանվի քլորոֆորմով:

3. Նուկլեինաթթվի/ռիբոզիմի բարձր պարունակությամբ հյուսվածքներ. փայծաղը/ուրմուսը ունի բարձր նուկլեինաթթվի և ռիբոզիմի պարունակություն:Հյուսվածքների մանրացումը սառեցման պայմաններում, որին հաջորդում է արագ համասեռացումը, կարող է արդյունավետորեն ապաակտիվացնել ռիբոզիմները:Այնուամենայնիվ, եթե լիզատը չափազանց մածուցիկ է (նուկլեինաթթվի բարձր պարունակության պատճառով), PCI արդյունահանումը չի կարողանա արդյունավետորեն շերտավորվել.ավելի շատ լիզատ ավելացնելը կարող է լուծել այս խնդիրը:Բազմաթիվ PCI արդյունահանումները կարող են հեռացնել ավելի շատ մնացորդային ԴՆԹ:Եթե ​​սպիրտ ավելացնելուց անմիջապես հետո առաջանում է սպիտակ նստվածք, դա վկայում է ԴՆԹ-ի աղտոտման մասին:Թթվային PCI-ով լուծարվելուց հետո կրկին արդյունահանումը կարող է հեռացնել ԴՆԹ-ի աղտոտումը:

4. Բուսական հյուսվածք. Բուսական հյուսվածքն ավելի բարդ է, քան կենդանական հյուսվածքը:Ընդհանուր առմամբ, բույսերը մանրացվում են հեղուկ ազոտի պայմաններում, ուստի ՌՆԹ-ի քայքայումը էնդոգեն ֆերմենտների կողմից հազվադեպ է:Եթե ​​քայքայման խնդիրը չի լուծվում, ապա այն գրեթե անկասկած պայմանավորված է նմուշում պարունակվող կեղտերով:Շատ բույսերում պարունակվող կեղտերը կհանգեցնեն մնացորդների, և մնացորդների պատճառը հաճախ այն է, որ այդ կեղտերը որոշ նմանություններ ունեն ՌՆԹ-ի հետ.Այս բնութագրերը որոշում են, որ դրանք շատ ուժեղ ֆերմենտային ինհիբիտորներ են:

Ներկայումս առևտրային ՌՆԹ-ի արդյունահանման ռեակտիվները կարող են հարմարեցվել գրեթե բոլոր կենդանական հյուսվածքներին փոքր ճշգրտումներով, բայց կան մի քանի առևտրային ՌՆԹ արդյունահանման ռեակտիվներ, որոնք կարող են հարմար լինել բույսերի հյուսվածքների մեծ մասի համար:Բարեբախտաբար, Foregene-ը կարող է հատուկ տրամադրելբույսերի ՌՆԹ արդյունահանման հավաքածուներ, մենք ունենքԲույսերի ընդհանուր RNA մեկուսացման հավաքածու, Plant Total RNA Isolation Kit Plus.Վերջինս հատուկ նախագծված է պոլիսախարիդների և պոլիֆենոլների բարձր պարունակությամբ բույսերի համար։ՌՆԹ արդյունահանման համար լաբորատոր օգտագործողների հետադարձ կապը հատկապես լավ է:

12. Նմուշի սառեցման և հալեցման ազդեցությունը Սառեցված նմուշը կարող է ավելի մեծ լինել, և այն պետք է կտրվի ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար օգտագործելուց առաջ:Կտրման ընթացքում նմուշները հակված են հալվելու (հնարավոր է մասամբ):Հնարավոր է, որ սառեցված նմուշները կշռվեն մինչև ՌՆԹ-ի արդյունահանումը, և այս գործընթացի ընթացքում անպայման հալեցումը տեղի կունենա:Երբեմն նմուշի հալեցումը տեղի է ունենում նաև հեղուկ ազոտի աղացման գործընթացում.կամ սառեցված նմուշը ուղղակիորեն ավելացվում է լիզատին՝ առանց հեղուկ ազոտի աղացման, և հալեցումը անպայման տեղի կունենա մինչև ամբողջական համասեռացումը:Փորձերը ցույց են տվել, որ սառեցված հյուսվածքը հալման ժամանակ ավելի հակված է ՌՆԹ-ի քայքայման, քան թարմ հյուսվածքները:Հավանական պատճառը. Սառեցման-հալման գործընթացը խաթարում է բջջի կառուցվածքները՝ հեշտացնելով էնդոգեն ֆերմենտների անմիջական շփումը ՌՆԹ-ի հետ:

13. ՌՆԹ որակի դատողություն Սովորաբար էլեկտրոֆորեզն օգտագործվում է ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը գնահատելու համար, իսկ A260/A280-ը՝ ՌՆԹ-ի մաքրությունը գնահատելու համար:Տեսականորեն անձեռնմխելի ՌՆԹ-ն ունի 28S:18S = 2,7:1 հարաբերակցություն, և տվյալների մեծ մասը շեշտում է 28S:18S = 2:1 հարաբերակցությունը:Բանն այն է, որ բջիջներից բացի այլ նմուշներից արդյունահանված ՌՆԹ-ներից գրեթե ոչ մեկը 2:1 հարաբերակցությամբ չէ (սա ստացվել է Agilent Bioanalyzer-ի միջոցով):

ՌՆԹ-ի էլեկտրոֆորեզի արդյունքների վրա ազդում են բազմաթիվ գործոններ, ներառյալ երկրորդական կառուցվածքը, էլեկտրոֆորեզի պայմանները, նմուշի ծանրաբեռնվածությունը, EB-ով հագեցվածության աստիճանը և այլն: Օգտագործեք բնիկ էլեկտրոֆորեզ՝ ՌՆԹ-ն հայտնաբերելու համար և օգտագործեք ԴՆԹ Մարկեր՝ որպես հսկիչ:Եթե ​​28S-ը 2kb-ում և 18S-ը 0.9kb-ում պարզ են, և 28S:18S>1, ապա ամբողջականությունը կարող է բավարարել հետագա փորձերի մեծ մասի պահանջները:

A260/A280-ը ցուցիչ է, որը մեծ շփոթություն է առաջացրել:Նախևառաջ անհրաժեշտ է պարզաբանել նուկլեինաթթուների համար այս ցուցանիշի սկզբնական նշանակությունը՝ մաքուր ՌՆԹ, դրա A260/280 = մոտ 2.0:Մաքուր ՌՆԹ-ն «պատճառն» է, իսկ A260/A280 = 2-ը «հետևանքն է»:Այժմ բոլորը օգտագործում են A260/A280 որպես «պատճառ», մտածելով, որ «եթե A260/A280 = 2, ապա ՌՆԹ-ն մաքուր է», ինչը բնականաբար հանգեցնում է շփոթության:

Եթե ​​դուք հետաքրքրված եք, կարող եք ավելացնել մի փոքր ռեակտիվ, որը հաճախ օգտագործվում է արդյունահանման մեջ, ինչպիսիք են ֆենոլը, գուանիդին իզոթիոցիանատը, PEG և այլն, ձեր ՌՆԹ-ի նմուշին, այնուհետև չափեք A260/A280 հարաբերակցությունը:Իրականությունն այն է, որ ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար օգտագործվող ռեակտիվներից շատերը, ինչպես նաև նմուշի բազմաթիվ կեղտերը կլանում են A260 և A280-ի մոտ՝ ազդելով A260/A280-ի վրա:

Ներկայումս առավել ուսանելի մոտեցումը ՌՆԹ-ի նմուշների սկանավորումն է 200-300 նմ միջակայքում:Մաքուր ՌՆԹ-ի կորն ունի հետևյալ բնութագրերը՝ կորը հարթ է, A230 և A260 երկու թեքության կետեր են, A300-ը մոտ է 0-ին, A260/A280 = շուրջ 2,0 և A260/A230 = շուրջ 2,0:Եթե ​​սկանավորման տվյալները հասանելի չեն, ապա պետք է որոշվի նաև A260/A230 հարաբերակցությունը, քանի որ այս հարաբերակցությունը ավելի զգայուն է բոլոր կեղտերի փոխանցման նկատմամբ, որոնք ազդում են ֆերմենտային ռեակցիայի վրա:Հաշվի առեք սարքի գծային տիրույթը (0,1–0,5 A260-ի համար):

Կան երկու այլ օգտակար երևույթներ. հարաբերակցությունը մոտ 0,3-ով ավելի ցածր կլինի, երբ A260/A280-ը չափվում է ջրի մեջ.մինչդեռ 10 մՄ EDTA-ով չափված հարաբերակցությունը մոտ 0.2-ով ավելի բարձր է, քան 1 մՄ EDTA-ում չափվածը:

Առնչվող ապրանքներ.

China Plant Total RNA Isolation Kit Արտադրող և Մատակարար |Foregene (foreivd.com)

ՌՆԹ մեկուսացման շարք Մատակարարներ և Գործարան |Չինաստանի ՌՆԹ մեկուսացման շարքի արտադրողներ (foreivd.com)

ՌՆԹ մեկուսացման շարք – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)