Սյունակը խցանվել է

Սյունակի խցանումից հետո ՌՆԹ-ի ելքը նվազում է կամ նույնիսկ անհնար է մաքրել ՌՆԹ-ն, իսկ ստացված ՌՆԹ զանգվածը ցածր է:

Ընդհանուր պատճառների վերլուծություն.

1. Նմուշի ընդմիջումները մանրակրկիտ չեն:

Նմուշի կոտրվելը չի ​​հանգեցնում ԴՆԹ-ՄԱՔՐՄԱՆ ՍՅՈՒՆԻ ամբողջությամբ արգելափակմանը՝ միաժամանակ ազդելով ՌՆԹ-ի ստացման և որակի վրա:Մենք խորհուրդ ենք տալիս արագ հղկել բավականաչափ հեղուկ ազոտի մեջ, երբ դուք կոտրում եք նմուշները, փորձեք ջախջախել նմուշի բջջային պատը, բջջային թաղանթը և այլ հյուսվածքները:Պոլիոլ պոլիսախարիդների բույսերի նմուշների համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել Plant Total RNA IOLATION KIT PLUS:

2. Առանձնացված նմուշի վերին նյութը ԴՆԹ-մաքրող սյունակով ներծծելիս, հնարավոր բջիջի մասնատված նստվածքը կարող է ներշնչվել:

Վերցված բջիջների մասնատված նստվածքները կառաջացնեն ՄԻԱՅՆ ՌՆԹ-ի սյունը, որը կփակվի, երբ կատարվի ՌՆԹ-ի կլանման գործողությունը (տես քայլ 6):Մենք խորհուրդ ենք տալիս ուշադիր ներծծել այս վերին նյութը, որպեսզի խուսափեք բջջային մնացորդներից:

3. Նմուշի սկզբնական գումարը չափազանց շատ է:

Նմուշի չափից ավելի օգտագործումը կհանգեցնի նմուշի թերի մասնատմանը կամ բուֆերային PSL1-ի կողմից բջիջների թերի լիզմանը, ինչը կհանգեցնի մաքրման ընթացքում մաքրման սյունակի արգելափակմանը:Բույսերի ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու Յուրաքանչյուր մաքրված գործառնական նմուշ 50 մգ է:Պոլիոլ պոլիսախարիդների բույսերի նմուշների համար խորհուրդ ենք տալիս փորձել Plant Total RNA IOLATION KIT PLUS-ը:

4. Ցենտրիֆուգի ջերմաստիճանը չափազանց ցածր է:

ՌՆԹ-ի մեկուսացման և մաքրման ողջ գործընթացն իրականացվում է սենյակային ջերմաստիճանում (20-25°C), բացառությամբ, որ նմուշի հյուսվածքը կոտրված է հեղուկ ազոտով: Որոշ կրիոգեն ցենտրիֆուգների ջերմաստիճանը 20-ից ցածր է:℃, որը կարող է առաջացնել ԴՆԹ-մաքրող սյունակի և/կամ միայն ՌՆԹ-ի սյունակի արգելափակում:Եթե ​​դա տեղի ունենա, ցենտրիֆուգի ջերմաստիճանը սահմանեք 20-25℃, ևհամոզվեք, որ լիզի խառնուրդը և (կամ) էթանոլով ավելացված վերին նյութը նախապես տաքացվել են մինչև 37°C.

Ոչ մի ՌՆԹ արդյունահանված կամ ՌՆԹ-ի ելքը ցածր է

Սովորաբար կան բազմաթիվ գործոններ, որոնք ազդում են վերականգնման արդյունավետության վրա, ինչպիսիք են՝ նմուշի ՌՆԹ-ի պարունակությունը, գործողության մեթոդը, լուծույթի ծավալը և այլն:

Ընդհանուր պատճառների վերլուծություն հետևյալ կերպ.

1. Վիրահատության ընթացքում կատարվել է սառցե լոգանք կամ ցածր ջերմաստիճանի (4°C) ցենտրիֆուգացիա:

Առաջարկ. Գործել սենյակային ջերմաստիճանում (15-25°Գ) ամբողջ գործընթացում մի արեք սառցե լոգանք և ցածր ջերմաստիճանի ցենտրիֆուգացիա:

2. ՌՆԹ-ն քայքայվել է նմուշի ոչ պատշաճ պահպանման կամ նմուշի երկարատև պահպանման պատճառով:

Առաջարկություն. Թարմ հավաքված նմուշները պետք է արագ սառեցվեն հեղուկ ազոտի մեջ, այնուհետև երկար ժամանակ պահպանվեն -80°C ջերմաստիճանում, խուսափել նմուշների կրկնակի սառեցումից և հալվելուց:կամ անմիջապես ներծծում են նմուշները RNA կայունացուցիչ RNAlater լուծույթում (կենդանիների նմուշներ):

3. Նմուշի անբավարար մասնատումը և լիզիսը հանգեցնում են մաքրման սյունակի արգելափակմանը:

Առաջարկ. Հյուսվածքը մանրացնելիս համոզվեք, որ հյուսվածքը բավականաչափ մանրացված է և արագ տեղափոխեք այն նախապես պատրաստված բուֆեր PSL1 (հաստատեք, որ β-ME-ի ճիշտ համամասնությունն ավելացվել է, տես ընթացակարգի 1-ին քայլը):

4. Էլյուենտը սխալ է ավելացվել:

Առաջարկ. Համոզվեք, որ RNase-Free ddH2O կաթում է մաքրման սյունակի թաղանթի մեջտեղը:

5. Բացարձակ էթանոլի ճիշտ ծավալը չի ​​ավելացվել Buffer PSL2-ին կամ Buffer PRW2-ին:

Առաջարկ. Խնդրում ենք հետևել հրահանգներին, ավելացնել բացարձակ էթանոլի ճիշտ ծավալը Buffer PSL2 և Buffer PRW2 և լավ խառնել մինչև փաթեթը օգտագործելը:

6. Հյուսվածքի նմուշի քանակը անհամապատասխան է:

Առաջարկ. Օգտագործեք 50 մգ հյուսվածք 500 մկլ բուֆեր PSL1-ի համար:Չափից շատ հյուսվածքի օգտագործումը կնվազեցնի արդյունահանվող ՌՆԹ-ի քանակությունը, իսկ արդյունքում ստացված ՌՆԹ-ի մաքրությունը նույնպես կնվազի:Մենք խստորեն խորհուրդ ենք տալիս, որ նախնական նմուշի չափաբաժինը չպետք է գերազանցի 50 մգ-ը մեկ ՌՆԹ-ի արդյունահանման գործողության համար:

7. Անհամապատասխան լուծվող ծավալը կամ թերի էլյուցիան:

Առաջարկություն. Մաքրման սյունակի էլուենտի ծավալը 50-200 մկլ է;եթե էլյուցիոն ազդեցությունը գոհացուցիչ չէ, խորհուրդ է տրվում երկարացնել ժամանակը սենյակային ջերմաստիճանում՝ նախապես տաքացված RNase-Free ddH2O ավելացնելուց հետո, օրինակ՝ 5-10 րոպե:

8. Մաքրման սյունը BufferPRW2-ով լվանալուց հետո ունի էթանոլի մնացորդ:

Առաջարկ. Եթե դատարկ խողովակը ցենտրիֆուգվում է 1 րոպե, և բուֆեր PRW2-ում լվանալուց հետո դեռ մնացել է էթանոլ, կարող եք դատարկ խողովակի ցենտրիֆուգման ժամանակը հասցնել 2 րոպեի, կամ մաքրման սյունը տեղադրել սենյակային ջերմաստիճանում 5 րոպե՝ մնացորդային էթանոլը լիովին հեռացնելու համար:

9. Կոմպլեկտը սխալ է օգտագործվել:

Առաջարկ. Պոլիֆենոլային պոլիսախարիդների բույսերի նմուշների համար սովորական փաթեթների օգտագործումը, ինչպիսին է Plant Total RNA Isolation Kit-ը, կարող է չկարողանալ ստանալ իդեալական ՌՆԹ նմուշներ:Խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել Plant Total RNA IsolationKit Plus-ը, որը հատուկ նախագծված է պոլիֆենոլային պոլիսախարիդային բույսերի նմուշների համար:Հավաքածու, որը հատուկ մշակվել է պոլիֆենոլից և պոլիսախարիդային բույսերի նմուշներից ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար:

OD260/OD280 արժեքը ցածր է

ՌՆԹ-ի էլյուցիան ddH2O-ով և օգտագործված սպեկտրոֆոտոմետրի ընթերցումների համար հանգեցնում է ցածր OD260/OD280 արժեքների:OD260/OD280 համեմատաբար ճիշտ արժեքներ ստանալու համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (ռանց RNase-ից զերծ ddH2O-ի փոխարեն), տե՛ս «ՌՆԹ-ի համակենտրոնացման և մաքրման փորձարկումները» էջ 19-ում:

Մաքրված ՌՆԹ-ն քայքայվում է

Մաքրված ՌՆԹ-ի որակը կապված է այնպիսի գործոնների հետ, ինչպիսիք են նմուշի պահպանումը, RNase-ով աղտոտվածությունը և մանիպուլյացիան:

Ընդհանուր պատճառների վերլուծություն.

1. Հյուսվածքների նմուշները հավաքագրվելուց հետո ժամանակին չեն պահպանվել:

Առաջարկություն. Եթե հյուսվածքների նմուշները հավաքելուց հետո ժամանակին չեն օգտագործվում, խնդրում ենք դրանք անմիջապես պահել հեղուկ ազոտի մեջ ցածր ջերմաստիճանում կամ տեղափոխել դրանք -80°C երկարաժամկետ պահպանման համար հեղուկ ազոտում արագ սառչելուց հետո, կամ անմիջապես ընկղմել նմուշները ՌՆԹ կայունացուցիչ RNAlater լուծույթում (կենդանիների նմուշներ):ՌՆԹ արդյունահանման համար փորձեք օգտագործել թարմ հավաքված հյուսվածքների նմուշներ:

2. Հյուսվածքների նմուշների կրկնվող սառեցում և հալեցում:

Առաջարկ. Հյուսվածքների նմուշները պահելու ժամանակ ավելի լավ է դրանք մանր կտրատել պահպանման համար և օգտագործելիս դրանց մի մասը հանել՝ խուսափելու համար նմուշների կրկնակի սառեցման և հալման հետևանքով առաջացած ՌՆԹ-ի քայքայումից:

3.RNase-ը ներդրված է վիրահատարանում կամ չի կրում միանգամյա օգտագործման ձեռնոցներ, դիմակներ և այլն:

Առաջարկ. ՌՆԹ-ի արդյունահանման փորձերը լավագույնս կատարվում են ՌՆԹ-ի առանձին գործողություններում, և լաբորատոր սեղանը պետք է մաքրվի փորձից առաջ, և փորձի ընթացքում պետք է կրել միանգամյա օգտագործման ձեռնոցներ և դիմակներ՝ RNase-ի ներմուծման հետևանքով առաջացած ՌՆԹ-ի մեծ չափով դեգրադացիայից խուսափելու համար:

4. Օգտագործման ընթացքում ռեագենտը աղտոտված է RNase-ով:

Առաջարկ. Փոխարինեք բույսերի ընդհանուր ՌՆԹ-ի արդյունահանման նոր շարքով համապատասխան փորձերի համար:

5. ՌՆԹ-ի մանիպուլյացիայի համար օգտագործվող ցենտրիֆուգային խողովակները և խողովակների ծայրերը աղտոտված են RNase-ով:

Առաջարկություն. Համոզվեք, որ ՌՆԹ-ի արդյունահանման մեջ օգտագործվող ցենտրիֆուգային խողովակները, խողովակների ծայրերը, պիպետները և այլն, բոլորն էլ չունեն RNase:

Հրահանգների ձեռնարկներ.

Plant Total RNA Isolation Kit Plus Հրահանգների ձեռնարկ