Մենք փորձառու արտադրող ենք եղել:Մեծամասնությունը շահելով իր շուկայի կարևոր հավաստագրերում Մեծ զեղչով Չինաստանի բարձր զգայունության մեկ քայլ զոնդով Rt-QpcrKit V2, որակը գործարանի կյանքն է, հաճախորդների պահանջարկի վրա կենտրոնանալը ընկերության գոյատևման և զարգացման աղբյուրն է, մենք հավատարիմ ենք ազնվությանը և բարեխիղճ աշխատանքային վերաբերմունքին՝ անհամբեր սպասելով ձեր գալուն:
Մենք փորձառու արտադրող ենք եղել:Մեծամասնությունը շահելով իր շուկայի կարևոր հավաստագրերումՉինական Taq ԴՆԹ պոլիմերազ, Qpcr, Մեր ընկերությունը խոստանում է՝ մատչելի գներ, արտադրության կարճ ժամանակ և գոհացուցիչ հետվաճառքի սպասարկում, մենք նաև ողջունում ենք ձեզ այցելել մեր գործարան ցանկացած ժամանակ, երբ ցանկանում եք:Ցանկանում եմ, որ հիմա մենք միասին ունենանք հաճելի և երկարաժամկետ բիզնես!!!

Նկարագրություններ

Այս հավաքածուն օգտագործում է լիզի բուֆերային եզակի համակարգ, որը կարող է արագորեն արձակել ՌՆԹ մշակված բջիջների նմուշներից RT-qPCR ռեակցիաների համար՝ դրանով իսկ վերացնելով ՌՆԹ-ի մաքրման ժամանակատար և աշխատատար գործընթացը:ՌՆԹ կաղապարը կարելի է ձեռք բերել ընդամենը 7 րոպեում։Հավաքածուի կողմից տրամադրված 5×Direct RT Mix և 2×Direct qPCR Mix-SYBR ռեակտիվները կարող են արագ և արդյունավետ կերպով ստանալ իրական ժամանակի քանակական PCR արդյունքները:

5×Direct RT Mix-ը և 2×Direct qPCR Mix-SYBR-ն ունեն ուժեղ արգելակող հանդուրժողականություն, և նմուշների լիզատը կարող է ուղղակիորեն օգտագործվել որպես ձևանմուշ RT-qPCR-ի համար:Այս փաթեթը պարունակում է եզակի ՌՆԹ բարձր հարաբերակցությամբ Foregene հակադարձ տրանսկրիպտազ և Hot D-Taq ԴՆԹ պոլիմերազ, dNTPs, MgCl:₂, ռեակցիայի բուֆեր, PCR օպտիմիզատոր և կայունացուցիչ:

Տեխնիկական պայմաններ

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Հավաքածուի բաղադրիչներ

Առանձնահատկություններ և առավելություններ

■ Պարզ և արդյունավետ. Cell Direct RT տեխնոլոգիայով ՌՆԹ-ի նմուշները կարելի է ստանալ ընդամենը 7 րոպեում:

■ Նմուշի պահանջարկը փոքր է, մինչև 10 բջիջ կարող է փորձարկվել:

■ Բարձր թողունակություն. այն կարող է արագ հայտնաբերել ՌՆԹ-ն 384, 96, 24, 12, 6 հորատանցքերի թիթեղներում մշակված բջիջներում:

■ ԴՆԹ ռետինը կարող է արագ հեռացնել ազատված գենոմները՝ զգալիորեն նվազեցնելով ազդեցությունը հետագա փորձարարական արդյունքների վրա:

■ Օպտիմիզացված RT և qPCR համակարգը դարձնում է երկքայլ RT-PCR հակադարձ տրանսկրիպցիան ավելի արդյունավետ, իսկ PCR-ն ավելի կոնկրետ և ավելի դիմացկուն RT-qPCR ռեակցիայի ինհիբիտորների նկատմամբ:

Կոմպլեկտի հավելված

Կիրառման շրջանակը՝ կուլտիվացված բջիջներ:

- Նմուշի լուծմամբ արձակված ՌՆԹ. կիրառելի է միայն այս փաթեթի RT-qPCR ձևանմուշի համար:

- Կոմպլեկտը կարող է օգտագործվել հետևյալ նպատակների համար՝ գենային էքսպրեսիայի վերլուծություն, siRNA միջնորդավորված գենի խլացման էֆեկտի ստուգում, դեղերի սքրինինգ և այլն։

Դիագրամ

Պահպանում և պահպանման ժամկետ

Այս փաթեթի I մասը պետք է պահվի 4℃ ջերմաստիճանում;Երկրորդ մասը պետք է պահվի -20℃ ջերմաստիճանում:

Foregene Protease Plus II-ը պետք է պահվի 4℃ ջերմաստիճանում, մի սառեցրեք -20℃:

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR պետք է պահվի -20℃ մթության մեջ;հաճախակի օգտագործման դեպքում այն ​​կարող է պահվել նաև 4℃ ջերմաստիճանում կարճաժամկետ պահպանման համար (օգտագործել 10 օրվա ընթացքում): Մենք փորձառու արտադրող ենք:Շահելով մեծամասնությունը իր շուկայի կարևոր վկայագրերում Մեծ զեղչով Չինաստանի Բարձր զգայունության մեկ քայլով զոնդ Rt-Qpcr Kit V2, Որակը գործարանի կյանքն է, Կենտրոնանալը հաճախորդների պահանջարկի վրա՝ ընկերության գոյատևման և զարգացման աղբյուրը, Մենք հավատարիմ ենք ազնվությանը և բարեխիղճ աշխատանքային վերաբերմունքին, անհամբեր սպասում ենք ձեր գալուն:
Մեծ զեղչՉինական Taq ԴՆԹ պոլիմերազ, Qpcr, Մեր ընկերությունը խոստանում է՝ ողջամիտ գներ, արտադրության կարճ ժամանակ և գոհացուցիչ հետվաճառքի սպասարկում, մենք նաև ողջունում ենք ձեզ այցելել մեր գործարան ցանկացած ժամանակ, երբ ցանկանում եք:Ցանկանում եմ, որ հիմա մենք միասին ունենանք հաճելի և երկարաժամկետ բիզնես!!!

QuickEասյTM Cell Direct RT-qՊՇՌ Kit -Թաքմan

կ.թ.ԴՐՏ-01021/01022

Բջջային ուղղակի RT-qPCR-ի համար՝ օգտագործելով ≤ 1000,000 բջիջ

Ապրանքի ներկայացում

Այս արտադրանքը օգտագործում է եզակի լիզի բուֆերային համակարգ՝ RT-qPCR ռեակցիաների համար մշակված բջիջների նմուշներից ՌՆԹ-ն արագ ազատելու համար՝ վերացնելով ՌՆԹ-ի ժամանակատար և աշխատատար մաքրման գործընթացը, և ընդամենը 7 րոպե՝ պահանջվող ՌՆԹ ձևանմուշը ստանալու համար՝ 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman-ի կողմից տրամադրված արագ և արդյունավետ որակի արդյունքներով:

5× Direct RT Mix-ը և 2× Direct qPCR Mix-Taqman-ն ունեն ուժեղ արգելակող հանդուրժողականություն և կարող են արդյունավետ հակադարձում և հատուկ ուժեղացում կատարել՝ օգտագործելով որպես ձևանմուշ չափվող նմուշի լիզատ:Ռեագենտը պարունակում է Foregene հակադարձ տրանսկրիպտազ, տաք D-Taq ԴՆԹ պոլիմերազ, dNTPs, MgCl₂Reaction Buffer, PCR Optimizer և Stabilizer, որոնք կարող են օգտագործվել լիզի բուֆերի հետ՝ նմուշները արագ և հեշտությամբ հայտնաբերելու համար և ունի բարձր զգայունության, յուրահատկության և կայունության բնութագրեր:

Ապրանքի Նկարագրություն

Պարզ, արդյունավետ Cell Direct RT տեխնոլոգիա, որը պահանջում է ընդամենը 7 րոպե ՌՆԹ նմուշներ ստանալու համար:

Նմուշի պահանջները փոքր են, և փորձարկման համար կարող են օգտագործվել նվազագույնը 10 մշակված բջիջներ:

Բարձր թողունակություն՝ 384, 96, 24, 12 և 6 հորատանցքային թիթեղների աճեցված բջիջների ՌՆԹ արագ ձեռքբերման համար:

ԴՆԹ ռետինն ի վիճակի է արագ հեռացնել ազատված գենոմները՝ զգալիորեն նվազեցնելով ազդեցությունը հետագա փորձարարական արդյունքների վրա:

Օպտիմիզացված RT և qPCR համակարգերը հնարավորություն են տալիս երկքայլ RT-PCR-ն ավելի արդյունավետ հակադարձ տառադարձմամբ, յուրահատկությամբ և RT-qPCR ռեակցիայի արգելակողին ավելի ուժեղ հանդուրժողականությամբ:

Կոմպլեկտի հավելված

Կիրառման շրջանակը՝ կուլտուրական բջիջներ:

Նմուշի լիզի մեկնաբանված ՌՆԹ. օգտագործվում է միայն որպես երկքայլ RT-qPCR ձևանմուշ:

Կոմպլեկտները կարող են օգտագործվել հետևյալ նպատակների համար՝ գենային կարգավորիչ էքսպրեսիայի վերլուծություն, ալելների թեստավորում, դեղերի սկրինինգ և այլն:

Հավաքածուի սահմանափակումներ

Ընդլայնված բեկորներ ≤ 300 bp.

Կոմպլեկտները օգտագործվում են թարմ բջիջների մշակման համար:

Ապրանքի որակի վերահսկում

Համաձայն FOREGENE-ի Ընդհանուր Որակի կառավարման համակարգի՝ Cell Direct RT-qPCR սերիայի փաթեթների յուրաքանչյուր խմբաքանակ խստորեն փորձարկվում է մի քանի անգամ՝ ապահովելու համար փաթեթների յուրաքանչյուր խմբաքանակի որակի հուսալիությունն ու կայունությունը:

Կոմպլեկտի բովանդակությունը

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman կարելի է գնել առանձին, մանրամասները ներկայացված են Հավելված 1-ում (ԷՋ 13):

Պահպանման պայմանները

1. Առաքման պայմանները

Ցածր ջերմաստիճանի սառույցի տուփի տեղափոխման ողջ գործընթացը՝ ապահովելու համար, որ փաթեթը գտնվում է <4 °C վիճակում:

2. Պահպանման պայմանները

Պահպանեք 1-ին մասը 4°C, իսկ II մասը -20°C ջերմաստիճանում:

Foregene Protease Plus II-ը պետք է պահվի 4°C ջերմաստիճանում, ոչ թե սառեցվի -20°C ջերմաստիճանում:

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman-ը պահվում է -20°C-ում կամ 4°C-ում՝ հաճախակի օգտագործման դեպքում (10 օրվա ընթացքում) կարճաժամկետ օգտագործման համար:

Հավաքածուի բաղադրիչի մասին տեղեկություններ

Բուֆեր CL: Ապահովում է բջիջների լիզի ռեակցիաների համար անհրաժեշտ միջավայր:

Բուֆեր ST. դադարեցնում է ակտիվ նյութը լիզատի մեջ՝ հետագա RT-ի վրա ազդեցությունից խուսափելու համար:

ԴՆԹ ջնջիչ. ԴՆԹ հեռացնող միջոց, գենոմի հեռացման ազդեցությունը հետագա փորձերի վրա:

5× Direct RT Mix. Պարունակում է ՌՆԹ-ի բարձր կապակցությամբ Foregene հակադարձ տրանսկրիպտազ, RNase արգելակող, dNTPs, կայունացուցիչներ, ուժեղացուցիչներ, օպտիմալացնողներ և հակադարձ տառադարձման պրայմերներ՝ օպտիմալ հավասարեցման համար (Random Primer, Oligo(dT)₁₈այբբենարան):

Foregene Protease Plus II. Լիզի բուֆերի համատեքստում բջիջները լիզվում են նուկլեինաթթուների ազատման համար:

2× Direct qPCR Mix-Taqman. Այս ռեագենտը պարունակում է տաք D-Taq ԴՆԹ պոլիմերազ, dNTPs, MgCl₂, ռեակցիայի բուֆեր, PCR օպտիմիզատոր և կայունացուցիչ։

20× ROX Reference Dye. Ընդհանրապես օգտագործվում է ABI, Stratagene և այլ ընկերությունների իրական ժամանակի PCR ուժեղացման գործիքների վրա, այն օգտագործվում է PCR խողովակների և խողովակների միջև PCR դոզավորման սխալների հետևանքով առաջացած տարբերությունը կարգավորելու համար:Տարբեր գործիքների համար պահանջվող 20× ROX Reference ներկի կոնցենտրացիան տարբեր է, և օգտագործողը կարող է այն ավելացնել՝ համաձայն գործիքի առաջարկվող կոնցենտրացիայի:

ՌՆազազերծ ddH₂O. ՌՆազազերծ ստերիլիզացված ծայրահեղ մաքուր ջուր երկքայլ RT-qPCR ռեակցիաների համար:

Նախազգուշական միջոցներ:(Հավաքածուն օգտագործելուց առաջ համոզվեք, որ ուշադիր կարդացեք նախազգուշական միջոցները)

Ուշադրություն դարձրեք փորձի շահագործման եղանակին, որպեսզի խուսափեք նմուշների միջև խաչաձեւ աղտոտումից:

Ուշադրություն դարձրեք փորձարարական միջավայրի և պարագաների մաքրությանը, որպեսզի խուսափեք RNase-ով աղտոտումից և ՌՆԹ-ի քայքայումից:

Վերցրեք թարմ կամ լավ պահպանված բջիջների նմուշներ և երբեք մի օգտագործեք սառեցված սառեցված բջիջների կրկնվող նմուշներ:

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman-ը պետք է խուսափի կրկնվող սառեցումից-հալեցումից, հակառակ դեպքում դա կազդի հակադարձ արտագրման և PCR արդյունավետության վրա:

Նախապատրաստչափաբաժիններնախքանշահագործման

Համոզվեք, որ ուշադիր կարդացեք հրահանգները այս հավաքածուն օգտագործելուց առաջ:Cell Direct RT-qPCR Kit-ը պարզ է, հարմար և արագ գործելու համար, և հրահանգները տրամադրում են ամբողջական տեղեկատվություն ամբողջ փաթեթի և այն ճիշտ օգտագործելու մասին:Օգտագործելուց առաջ խնդրում ենք պատրաստել անհրաժեշտ փորձարարական նյութերն ու սարքավորումները:

Փորձարարական նյութեր և սարքավորումներ

◆ Մշակույթի բջիջներ.

◆ 1,5 մլ կամ 2 մլ, RNase-/DNase-Free ցենտրիֆուգային խողովակ, RNase-/DNase-Free ծայր, 0,2 մլ ստերիլ qPCR խողովակ:

◆ qPCR մեքենա, պիպետտ, սեղանի ցենտրիֆուգ (≥13,400×է) (կախված փորձարարական կարիքներից) և այլն:

Անվտանգություն

◆ Այս ապրանքը նախատեսված է միայն գիտահետազոտական ​​նպատակների համար, խնդրում ենք մի օգտագործեք այն դեղագործական, կլինիկական, սննդի և կոսմետիկ նպատակների համար:

◆ Քիմիական նյութեր օգտագործելիս կրեք համապատասխան լաբորատոր հագուստ, ձեռնոցներ, պաշտպանիչ ակնոցներ և այլն:

Գործողությունուղեցույցներ

Բջջային Լիզիս համակարգերը, RT համակարգերը և qPCR ռեակցիայի լուծույթի հավելումների փաթեթները կարելի է գնել առանձին, մանրամասների համար Հավելված 1-ում (ԷՋ 13):

Գործողության ուղեցույց

A: Նմուշի ՌՆԹ-ի թողարկում

1. Բջիջները նախապես մշակվել են. Բջջային կուլտուրայի թիթեղը լվանալ սառը PBS-ով, այնուհետև լուծարել բջիջները (10-10⁶), 10⁶ քան բջիջների քանակից, առաջարկվում է Foregene the Cell and RNA Isolation Kit the Total (DE-03111) կամ Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) ՌՆԹ արդյունահանման և մաքրման համար:

1.1.Կպչուն բջիջներ (24 ջրհորի ափսե որպես օրինակ)

1.1.1.Որոշեք յուրաքանչյուր ջրհորի բջիջների քանակը, որոշեք, որ բջիջների թիվը 1 × 10 է⁵և օգտագործեք պիպետ՝ կուլտուրայի ափսեից հեռացնելու համար:

1.1.2.Յուրաքանչյուր հորի մեջ ավելացրեք 200 մկլ նախապես սառեցված 1 × PBS:Մի քանի անգամ մի խողովակավորեք և PBS-ը հանեք հորերից:Թեքեք ափսեը և հանեք որքան հնարավոր է շատ PBS:Անցեք քայլ 2-ին:

1.1.3.Բջջային կուլտուրայի տարբեր ճաշատեսակ կամ տեղեկատու աղյուսակ 1-1 բջիջների կուլտուրայի ճաշատեսակում ավելացվել է նախապես սառեցված 1 × PBS բջիջները լվանալու համար:

Աղյուսակ 1-1. PBS դեղաչափը տարբեր թվով բջիջների համար

Նշում:Ապահովել ամուր կպչուն բջիջներ,Լվացքի ժամանակ խուսափել է մեծ քանակությամբ բջիջների կորստից:

1.2.Կախովի բջիջները կամ կպչուն բջիջները մշակված են ոչ ծակոտկեն թիթեղներում

1.2.1.Կպչուն բջիջները, որոնք մշակվել են ոչ բազմաբնակարան հորատանցքերում (կասեցման բջիջները սկսվում են 1.2.2 հաջորդ քայլից), հավաքում և առանձնացնում են բջիջները բջիջների հավաքման սովորական մեթոդի համաձայն և դրանք տեղադրում կուլտուրայի ափսեի կամ ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ.եթե օգտագործվում է տրիպսինիզացիա, ապա պահանջվում է ցենտրիֆուգում՝ բջիջները հավաքելու և մնացորդային տրիպսինը հեռացնելու համար, PBS-ով վերագործարկված բջիջները ավելացվել են առանձին բջիջների մեջ՝ բջիջները ցրելու համար:

1.2.2.Հաշվարկված բջիջների քանակից հետո բջիջները բաժանվեցին 1×10⁵ մեկը ցենտրիֆուգել խողովակները, հավաքել բջիջները ցենտրիֆուգման միջոցով 1000 × գ 10 րոպեի ընթացքում:

1.2.3.Ավելացրեք 200 մկլ PBS ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, մի քանի անգամ մի խողովակավորեք և ուղղակիորեն շնչեք PBS:անցեք 2-րդ քայլին: (Եթե դժվար է նստել, և բջիջները կրկին կասեցվել են, կարող է իրականացվել 1000×g ցենտրիֆուգված՝ գերնույն հեղուկը հեռացնելուց 10 րոպե հետո, բջջային գնդիկը անցնել 2-րդ քայլին)

2. Բջջի լիզում. Հեռացրեք բուֆեր CL-ը, որի ջերմաստիճանը հավասարեցված է սենյակային ջերմաստիճանին, ԴՆԹ ռետին և Foregene Protease Plus II-ը, համաձայն հետևյալ աղյուսակ 1-2-ի պատրաստված լիզի համակարգի. (Լիզիսի լուծույթը պատրաստ է օգտագործման):

Աղյուսակ 1-2. ճեղքվածք համակարգի պատրաստում (Ծանոթագրություն՝ սառույցի վրա պատրաստման մեջ)

3.( 24 հորատանցքի ափսե, որպես օրինակ) 200 մկլ բջջի լիզի հիմնական խառնուրդ յուրաքանչյուր հորի մեջ, Կրկնակի փչել 5-10 անգամ, Ինկուբացնել սենյակային ջերմաստիճանում (20-25 ℃) 5 րոպե:

Նշում:Պղպջակների առաջացումից խուսափելու համար, պիպետտավորման ժամանակ, պիպետտի սանդղակը հարմարեցված է մինչև 200 μl կամ ավելի քիչ:Լիզիզից հետո բջիջները կարող են պղտորվել, ինչը նորմալ է:

4. (24 – ափսե, որպես օրինակ) ավելացվում է հեղուկի մեջ 20 μl բուֆեր ST (տարբեր lysis համակարգեր Բուֆեր ST ավելացված քանակով, որը ցույց է տրված Աղյուսակ 1-3-ում), կրկնվել է 5-10 անգամ, սենյակային ջերմաստիճանում (20-25 ℃) ինկուբացվել է 2 րոպե:

Նշում:Պիպետտի ծայրը դրված է մակերեսի տակ՝ ապահովելով, որ լիզատը ավելացված է,փուչիկների առաջացումից խուսափելու համար խնդրում ենք, երբ pipetting-ի սանդղակը ճշգրտվել է մինչև 200 μl կամ ավելի քիչ:

Աղյուսակ 1-3:Ավելացնել բուֆեր ST

5. Լիզատը օգտագործվում է հետագա RT-qPCR փորձերի համար:Եթե ​​հետագա փորձերը ժամանակին չեն կարող իրականացվել, խնդրում ենք պահել այն սառույցի վրա ոչ ավելի, քան 2 ժամ և պահել -20℃ կամ -80℃ (ոչ ավելի, քան երեք ամիս):

B. RT համակարգի պատրաստում

1. Հանեք 5 × Direct RT Mix-ը և դրեք սառցե բաղնիքի վրա, թողեք, որ բնականաբար հալվի և նրբորեն խառնեք այն հետագա օգտագործման համար;հանեք RNase-Free ddH2O և հալեցրեք այն և դրեք սառցե լոգանքի վրա՝ հետագայում օգտագործելու համար:Պատրաստեք ռեակցիայի համակարգը սառույցի վրա՝ համաձայն ստորև բերված Աղյուսակ 2-1-ի:

Աղյուսակ 2-1. RT ռեակցիայի համակարգի պատրաստում

2. Համակարգի ձևակերպումն ավարտելուց հետո նրբորեն խառնվել և ցենտրիֆուգվել է հետևյալ աղյուսակում 2 -2 ռեակցիայի պայմանները RT ռեակցիա:

Աղյուսակ 2-2. RT ռեակցիայի պայմանի կարգավորում

3. Ռեակցիայի ավարտից հետո ռեակցիայի արտադրանքը ուղղակիորեն տեղադրվեց սառույցի վրա qPCR-ի համար, խնդրում ենք դնել երկարատև պահպանումը -20℃ կամ -80℃:

Նշում. չմաքրված ձևանմուշի օգտագործման պատճառով հակադարձ արտագրման արտադրանքում կարող են հայտնվել սպիտակ նստվածքներ:Սա նորմալ երեւույթ է։Անմիջապես ցենտրիֆուգեք վերին նյութը հետագա փորձերի համար:

Ստացված RT ռեակցիայի լուծույթը ավելացվում է հաջորդ քայլ իրական ժամանակում PCR ռեակցիայի համակարգերին, խորհուրդ է տրվում ավելացնել ռեակցիաների համակարգի 10-30%-ից տատանվող քանակություններ:

C: qPCR ռեակցիայի համակարգի պատրաստում

1. Բ-ի համապատասխան քանակությունը պատրաստված է քայլ cDNA ձևանմուշում՝ համաձայն հետևյալ աղյուսակ 3-1-ի՝ ռեակցիայի համակարգ պատրաստելու համար:

Նշում. cDNA ձևանմուշի քանակը կազմում է qPCR համակարգի 10-30%-ը:Օրինակ, 20 մկլ qPCR համակարգում ավելացրեք 2-6 մկլ լիզի բուֆեր, բայց ոչ ավելի, քան 6 մկլ:

2. Օպտիմալացման լավ qPCR պայմաններ (կռռման ջերմաստիճան և այլն) qPCR ռեակցիայի համար (Աղյուսակ 3-2-ում տրված ռեակցիայի պայմանները):

Նշում. Փորձեք օգտագործել օպտիմիզացված պայմաններ qPCR ռեակցիաների համար՝ ավելի լավ արդյունքներ ստանալու համար:

Աղյուսակ 3-1. ՊՇՌ ռեակցիայի համակարգի պատրաստում

1*. Այբբենարանի կոնցենտրացիան կարող է ճշգրտվել 50-900 նՄ միջակայքում, երբ այբբենարանի ռեակցիայի արդյունավետությունը վատ է:

Նշում. qPCR համակարգը կարող է ճշգրտվել ըստ փորձարարական կարիքների և լյումինեսցենտային ցիկլերի մոդելի:qPCR-ի համար 50-ումμլ համակարգով, կարգավորեք ռեագենտի դեղաչափը համամասնորեն՝ համաձայն 20-իμլ համակարգ.

2*. Ընտրեք ROX Reference Dye-ի համապատասխան վերջնական կոնցենտրացիան՝ ըստ լյումինեսցենտային քանակական ջերմային ցիկլերի:Ընդհանուր ֆլուորեսցենտային քանակական ցիկլերների համար ROX Reference ներկերի ամենահարմար կոնցենտրացիաները ներկայացված են ստորև բերված աղյուսակում.

Աղյուսակ 3-2. տրամադրված են qPCR ռեակցիայի պայմանները

Նշում. Լավագույն qPCR էֆեկտ ստանալու համար գրադիենտ PCR-ը կարող է օգտագործվել տարբեր ձևանմուշների և տարբեր պրայմերների արձագանքման պայմանները օպտիմալացնելու համար:PCR ռեակցիայի պայմանները տատանվում են՝ կախված ֆլուորեսցենտային անալիզատորից, ձևանմուշից, այբբենարանից և այլն: Հատուկ գործողության ընթացքում օպտիմալ ռեակցիայի պայմանները պետք է նախագծվեն՝ ելնելով ֆլյուորեսցենտային քանակական ջերմային ցիկլերի հատուկ պայմաններից, ձևանմուշի տեսակից, հետաքրքրող հատվածի չափից, ուժեղացված հատվածի բազային հաջորդականությունից և GC-ի պարունակությունից և պրայմերների երկարությունից, ներառյալ ռեակցիայի ժամանակը և այլն:

Իրական ժամանակում PCR պրայմերների նախագծման սկզբունքները

Forward Primer և Reverse Primer

Իրական ժամանակում PCR-ի համար այբբենարանի ձևավորումը շատ կարևոր է:Պրայմերները կապված են PCR ուժեղացման առանձնահատկությունների և արդյունավետության հետ և կարող են նախագծվել հետևյալ սկզբունքներով.

◆ Այբբենարանի երկարությունը՝ 18-30bp։

◆ GC պարունակությունը՝ 40-60%:

◆ Tm արժեք. Primer նախագծման ծրագրակազմը, ինչպիսին է Primer 5-ը, կարող է տալ այբբենարանի Tm արժեքը:Վերև և ներքև գտնվող այբբենարանների Tm արժեքները պետք է հնարավորինս մոտ լինեն:Կարող է օգտագործվել նաև Tm հաշվարկման բանաձևը՝ Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T):PCR-ն իրականացնելիս որպես եռացման ջերմաստիճան սովորաբար ընտրվում է պրայմերային Tm արժեքից ցածր 5 °C ջերմաստիճան (եռացման ջերմաստիճանի համապատասխան աճը կարող է մեծացնել PCR ռեակցիայի առանձնահատկությունը):

◆ Պրայմերներ և PCR արտադրանք.

◆ Դիզայնի այբբենարանի PCR ուժեղացման արտադրանքի երկարությունը նախընտրելի է 100-150 bp:

◆ Կաղապարի երկրորդական կառուցվածքային տարածքում նախագծային այբբենարանները պետք է հնարավորինս խուսափել:

◆ Խուսափեք 2 կամ ավելի փոխլրացնող հիմքերի ձևավորումից վերև և ներքև գտնվող այբբենարանների 3' ծայրերի միջև:

◆ Primer 3′ տերմինալային հիմքը չի կարող առկա լինել 3 լրացուցիչ հաջորդական G կամ C-ով:

◆ Պրայմերներն իրենք չեն կարող ունենալ փոխլրացնող կառուցվածք, հակառակ դեպքում կձևավորվի մազակալի կառուցվածք, որը կազդի PCR ուժեղացման վրա:

◆ ATCG-ն պետք է հնարավորինս հավասարաչափ բաշխվի այբբենարանի հաջորդականությամբ, և 3' տերմինալային հիմքը պետք է խուսափել, քանի որ T.

Հավելված1:Cell DirectRT-qPCR Հավաքածուի բաղադրիչt հավելումների փաթեթ

1.Cell Lysis Solution