Escherichia coli O157:H7 նուկլեինաթթվի հայտնաբերման հավաքածու (PCR լյումինեսցենտային զոնդի մեթոդ)
Հավաքածուի նկարագրություն.
Cat.No.FP102
Այն օգտագործվում է E. coli O157:H7-ի արագ հայտնաբերման և զննման համար սննդամթերքի, կերի, ջրի և շրջակա միջավայրի նմուշներում:
Նկարագրություններ
Այն օգտագործվում է E. coli O157:H7-ի արագ հայտնաբերման և զննման համար սննդամթերքի, կերերի, ջրի և շրջակա միջավայրի նմուշներում:
[Թեստավորման սկզբունք]Ֆլուորեսցենտային PCR տեխնոլոգիայի սկզբունքի համաձայն՝ հատուկ պրայմերները և Taqman զոնդերը նախագծված են Escherichia coli O157՝ H7 հատուկ գենի համար և հայտնաբերվում են լյումինեսցենտային PCR գործիքով, որպեսզի իրականացնեն Escherichia coli O157: H7 ԴՆԹ-ի որակական հայտնաբերումը:
Հավաքածուի բովանդակություն
Նշում. ROX ալիքի զոնդը ներառված չէ:
| Cբաղադրիչները | Հստակեցում | Qմիաբանություն |
| Բուֆեր Ա | Խողովակ | 1 |
| Բուֆեր Բ | Խողովակ | 1 |
| Դրական վերահսկողություն | Խողովակ | 1 |
| Բացասական վերահսկողություն | Խողովակ | 1 |
Սպասվող օգտագործումը
Այն օգտագործվում է E. coli O157:H7-ի արագ հայտնաբերում և զննում սննդի, կերի, ջրի և շրջակա միջավայրի նմուշներում:
Պահպանման պայմանները և պիտանելիության ժամկետը
Պահել -20℃ մթության մեջ և խուսափել կրկնվող սառցակալումից և հալվելուց:
Գործողության ժամկետը 12 էամիսներ, իսկ արտադրության ամսաթիվը նշված է արտաքին փաթեթավորման վրա:
Գործիքներ և ծախսվող նյութեր
Լյումինեսցենտային քանակական PCR գործիք, պիպետային ատրճանակ և համապատասխան ծայրեր, պտտվող ցնցում, մինի ցենտրիֆուգ:
Օգտագործումը
1. Նմուշների մշակում
1.1 Նմուշի տեսակ. Այս հավաքածուն հարմար է սննդի, կերերի, ջրի նմուշների և այլ նմուշների համար, որոնք կասկածվում են Escherichia coli O157:H7-ով աղտոտված լինելու համար:Խորը վերամշակված մսամթերքի, ըմպելիքների և գունանյութեր պարունակող այլ նյութերի դեպքում դրանք պետք է ողողվեն՝ ֆլյուորեսցենտային ազդանշանների հավաքման վրա ազդելու համար:
1.2 Նմուշի մշակում. տես «GB 4789.10-2016 Սննդի անվտանգության ազգային ստանդարտ սննդամթերքի մանրէաբանական հետազոտություն Escherichia coli O157. H7 թեստ» նմուշի պատրաստման, հարստացման կուլտուրաների և Escherichia coli O157-ի մեկուսացման համար՝ H7:
- Nուկլեինաթթվի արդյունահանում
Վերցրեք 20 մլ հարստացնող լուծույթ 1,5 մլ ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ, ավելացրեք 200 մկլ մանրէաբանական լիզատ (պահանջվում է լրացուցիչ փաթեթ), պտտեցնել 30 վայրկյան, կարճ ժամանակով ցենտրիֆուգել և մի կողմ դնել:
Դիտողություններ. Լիզատից նուկլեինաթթվի արդյունահանումը պետք է ավարտվի 10 րոպեի ընթացքում և չի կարող երկար պահպանվել:
3. Նուկլեինաթթվի ուժեղացում
3.1 Միացրեք լյումինեսցենտային քանակական PCR գործիքը օգտագործման համար:
Բուֆեր A-ն և B-ն փաթեթից, մանրակրկիտ հալեցրեք դրանք և կարճ ժամանակով ցենտրիֆուգեք:ՊՇՌ ռեակցիայի յուրաքանչյուր խողովակին ավելացրեք 18 մկլ բուֆեր A և 2 մկլ բուֆեր B:Այնուհետև ավելացրեք 5 մլ բացասական հսկողություն, արդյունահանված նուկլեինաթթու և դրական հսկողություն PCR ռեակցիայի խողովակների մեջ, փակեք խողովակները և կարճ ժամանակով ցենտրիֆուգեք:
3.3 Տեղափոխեք PCR ռեակցիայի խողովակը լյումինեսցենտային PCR սարքի և օգտագործեք հետևյալ ընթացակարգերը ուժեղացման փորձեր կատարելու համար. ընտրեք 25 մլ ռեակցիոն համակարգի համար, հավաքեք լյումինեսցենտային ազդանշաններ 60°C-ում յուրաքանչյուր ցիկլի համար և ընտրեք FAM հայտնաբերման ալիքի համար:
| Քայլ | Ծրագիր | Ցիկլերի քանակը |
| 1 | 37℃ 5ր | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 րոպե | 1 |
| 3 | 95°C 15վրկ | 4 0 |
| 60℃ 30 վրկ (հավաքում է լյումինեսցենտը) |
Խնդիրների վերլուծության ուղեցույցներ
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
ՌՆԹ-ն չի կարող արդյունահանվել կամ նուկլեինաթթվի ելքը ցածր է
Սովորաբար կան բազմաթիվ գործոններ, որոնք ազդում են վերականգնման արդյունավետության վրա, ինչպիսիք են՝ նմուշի ՌՆԹ-ի պարունակությունը, գործողության եղանակը, զտման ծավալը և այլն։
Ընդհանուր պատճառների վերլուծություն.
1. Սառցե լոգանք կամ ցածր ջերմաստիճանի (4 ° C) ցենտրիֆուգացիա շահագործման ընթացքում:
Առաջարկ. Սենյակի ջերմաստիճանի (15-25°C) աշխատանք, երբեք սառցե լոգարան և ցածր ջերմաստիճանի ցենտրիֆուգ:
2. Նմուշների ոչ պատշաճ պահեստավորում կամ նմուշների չափազանց երկար պահպանում:
Առաջարկ. Նմուշները պահել -80 ° C ջերմաստիճանում կամ սառեցնել հեղուկ ազոտի մեջ և խուսափել սառեցման և հալեցման կրկնակի օգտագործումից;փորձեք օգտագործել թարմ հավաքված նմուշներ ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար:
3. Անբավարար նմուշի լիզ
Առաջարկություն. Խնդրում ենք համոզվել, որ նմուշը և աշխատանքային լուծույթը (գծային ակրիլամիդ) մանրակրկիտ խառնվել և 10 րոպե ինկուբացվել են սենյակային ջերմաստիճանում (15-25°C)
4. Էլյուենտը սխալ է ավելացվել
Առաջարկություն. Համոզվեք, որ RNase-Free ddH2O ավելացված է մաքրման սյունակի մեմբրանի մեջտեղում:
5. Անջուր էթանոլի ոչ պատշաճ ծավալը Buffer viRW2-ում
Առաջարկ. Խնդրում ենք հետևել հրահանգներին, ավելացնել անջուր էթանոլի ճիշտ ծավալը Buffer viRW2-ին և լավ խառնել դրանք նախքան հավաքածուն օգտագործելը:
6. Անպատշաճ նմուշի օգտագործում:
Առաջարկ. 200 մկլ նմուշ 500 մկլ բուֆերային viRL-ի համար:Նմուշի չափազանց մեծ ծավալը կհանգեցնի ՌՆԹ-ի արդյունահանման արագության նվազմանը:
7. Սխալ զտման ծավալը կամ թերի էլյուցիան:
Առաջարկություն. Մաքրման սյունակի էլուենտի ծավալը 30-50 մկլ է;եթե էլյուցիոն էֆեկտը գոհացուցիչ չէ, խորհուրդ է տրվում ավելացնել նախապես տաքացված RNase-Free ddH2O և երկարացնել սենյակային ջերմաստիճանում դնելու ժամանակը, օրինակ՝ 5-10 րոպե
8. Մաքրման սյունը բուֆերային viRW2-ում ողողելուց հետո էթանոլի մնացորդ ունի:
Առաջարկ. Եթե բուֆերային viRW2-ում ողողելուց և դատարկ խողովակով 2 րոպե ցենտրիֆուգելուց հետո էթանոլը դեռ մնում է, ապա դատարկ խողովակով ցենտրիֆուգումից հետո մաքրման սյունը կարող է 5 րոպե թողնել սենյակային ջերմաստիճանում՝ մնացած էթանոլը լիովին հեռացնելու համար:
Մաքրված ՌՆԹ մոլեկուլների քայքայումը
Մաքրված ՌՆԹ-ի որակը կապված է այնպիսի գործոնների հետ, ինչպիսիք են նմուշների պահպանումը, RNase-ի աղտոտումը և շահագործումը:
Ընդհանուր պատճառների վերլուծություն.
1. Հավաքված նմուշները ժամանակին չեն պահպանվել։
Առաջարկ. Եթե նմուշը հավաքելուց հետո ժամանակին չի օգտագործվում, խնդրում ենք անմիջապես պահել այն -80 ℃ կամ հեղուկ ազոտով:ՌՆԹ մոլեկուլների արդյունահանման համար հնարավորության դեպքում փորձեք օգտագործել թարմ հավաքված նմուշներ:
2. Հավաքված նմուշները բազմիցս սառչում էին և հալեցնում:
Առաջարկ. Նմուշների հավաքման և պահպանման ընթացքում խուսափել կրկնվող սառեցումից և հալվելուց (ոչ ավելի, քան մեկ անգամ), հակառակ դեպքում նուկլեինաթթվի պարունակությունը կնվազի:
3. RNase ներմուծվել է վիրահատարանում կամ չեն կրել միանգամյա օգտագործման ձեռնոցներ, դիմակներ և այլն:
Առաջարկ. ՌՆԹ մոլեկուլների արդյունահանումը փորձարկումը լավագույնս կատարվում է առանձին ՌՆԹ վիրահատության սենյակում, իսկ փորձնական աղյուսակը մաքրվում է փորձից առաջ:Փորձի ընթացքում կրեք միանգամյա օգտագործման ձեռնոցներ և դիմակներ, որպեսզի խուսափեք ՌՆԹ-ի քայքայումից, որն առաջանում է RNase-ի ներմուծման հետևանքով:
4. Օգտագործման ընթացքում ռեագենտը աղտոտված է RNase-ով:
Առաջարկ. Փոխարինեք վիրուսային ՌՆԹ-ի մեկուսացման նոր հավաքածուով համապատասխան փորձերի համար:
5. Ցենտրիֆուգային խողովակների, պիպետտի ծայրերի և այլնի RNase աղտոտումը: Առաջարկ. Համոզվեք, որ ցենտրիֆուգային խողովակները, պիպետտների ծայրերը և պիպետները բոլորն էլ RNase-ից զերծ են:
ՌՆԹ-ի մաքրված մոլեկուլները ազդել են հոսանքով ներքև գտնվող փորձերի վրա
ՌՆԹ-ի մոլեկուլները, որոնք մաքրվում են մաքրման սյունակով, կազդեն ներքևի փորձերի վրա, եթե կան շատ աղի իոններ կամ սպիտակուցներ, ինչպիսիք են՝ հակադարձ տրանսկրիպցիան, Հյուսիսային բծը և այլն։
1. Էլյուտավորված ՌՆԹ մոլեկուլներում կան աղի իոններ:
Առաջարկություն. Համոզվեք, որ անջուր էթանոլի ճիշտ ծավալը ավելացվել է Buffer viRW2-ին և լվացեք մաքրման սյունը երկու անգամ՝ համաձայն գործառնական հրահանգների մեջ նշված ճիշտ ցենտրիֆուգման արագության: Եթե դեռ աղի իոններ են մնացել, կարող եք ավելացնել Buffer viRW2 մաքրման սյունակում և թողնել այն սենյակային ջերմաստիճանում 5 րոպե:Այնուհետև կատարեք ցենտրիֆուգում՝ աղի իոններով աղտոտվածությունը առավելագույն չափով հեռացնելու համար
2. Էլյուտավորված ՌՆԹ-ի մոլեկուլներում մնացած էթանոլ կա
Առաջարկ. Երբ հաստատելով, որ մաքրման սյունակները ողողվել են Buffer viRW2-ով, կատարեք դատարկ խողովակով ցենտրիֆուգում՝ համաձայն գործառնական հրահանգների վրա նշված կենտրոնախույս արագության:Եթե դեռ էթանոլ է մնացել, այն կարելի է թողնել 5 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում դատարկ խողովակով ցենտրիֆուգումից հետո, որպեսզի մնացած էթանոլը առավելագույն չափով հեռացվի:
Հրահանգների ձեռնարկներ.
Վիրուսային ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածուի հրահանգների ձեռնարկ
