1. Հայտնաբերել ՌՆԹ լուծույթի կլանումը
280, 320, 230 և 260 նմ ներծծումը ներկայացնում է համապատասխանաբար նուկլեինաթթվի, ֆոնի (լուծույթի պղտորություն), աղի կոնցենտրացիայի և օրգանական նյութերի, օրինակ՝ սպիտակուցի արժեքները:Ընդհանրապես նայեք միայն OD260/OD280-ին (հարաբերակցությունը, R):Երբ 1.8-2.0, մենք կարծում ենք, որ ՌՆԹ-ում սպիտակուցի կամ այլ օրգանական նյութերի աղտոտումը կարող է հանդուրժվել, սակայն պետք է նշել, որ երբ Tris-ը օգտագործվում է որպես բուֆեր՝ աբսորբցիան հայտնաբերելու համար, R արժեքը կարող է լինել 2-ից մեծ (ընդհանուր առմամբ այն պետք է լինի <2.2):Երբ R<1.8, լուծույթում սպիտակուցի կամ այլ օրգանական նյութերի աղտոտումն ավելի ակնհայտ է, և ՌՆԹ-ի ճակատագիրը կարելի է որոշել ըստ կարիքների։Երբ R>2.2, դա նշանակում է, որ ՌՆԹ-ն հիդրոլիզացվել է մեկ նուկլեինաթթվի:
2.ՌՆԹ-ի էլեկտրաֆորետիկ օրինաչափություն
Ընդհանրապես, դենատուրացնող գելը օգտագործվում է ՌՆԹ-ի էլեկտրոֆորեզի համար, բայց եթե դա միայն ՌՆԹ-ի որակի հայտնաբերման համար է, ապա բնափոխող գելը անհրաժեշտ չէ, և կարելի է օգտագործել սովորական ագարոզայի գելը:Էլեկտրոֆորեզի նպատակն է հայտնաբերել 28S և 18S գոտիների ամբողջականությունը և դրանց հարաբերակցությունը կամ mRNA քսուքի ամբողջականությունը:Ընդհանրապես, եթե 28S և 18S գոտիները վառ են, պարզ և սուր (նկատի ունենալով շերտերի եզրերը պարզ են), իսկ 28S-ի պայծառությունը կրկնակի ավելի է, քան 18S գոտին, մենք ՌՆԹ-ի որակը լավ ենք համարում:
Վերոհիշյալ երկու մեթոդներն են, որոնք մենք սովորաբար օգտագործում ենք, բայց այս երկու մեթոդներից և ոչ մեկը չի կարող մեզ հստակ ասել, թե արդյոք ՌՆԹ լուծույթում կա մնացորդային RNase:Եթե լուծույթում շատ փոքր քանակությամբ RNase կա, մեզ համար դժվար է այն հայտնաբերել վերը նշված մեթոդով, սակայն հետագա ֆերմենտային ռեակցիաների մեծ մասն իրականացվում է 37 աստիճանից բարձր ջերմաստիճանում և երկար ժամանակ։Այս կերպ, եթե ՌՆԹ-ի լուծույթում կա շատ փոքր քանակությամբ RNase, ապա կլինի շատ հարմար միջավայր և ժամանակ հետագա փորձերում իրենց դերը կատարելու համար, և իհարկե փորձը այս պահին սառը կլինի։Ստորև ներկայացնում ենք մի մեթոդ, որը կարող է հաստատել, թե արդյոք ՌՆԹ լուծույթում կա մնացորդային RNase:
3. Ջերմության պահպանման փորձարկում
Համաձայն նմուշի կոնցենտրացիայի, ՌՆԹ լուծույթից քաշեք երկու 1000 նգ ՌՆԹ և ավելացրեք այն 0,5 մլ ցենտրիֆուգային խողովակի մեջ և լրացրեք այն pH 7,0 Tris բուֆերով՝ մինչև 10 մլ ընդհանուր ծավալը, այնուհետև փակեք խողովակի գլխարկը:Դրանցից մեկը դրեք 70°C մշտական ջերմաստիճանի ջրային բաղնիքի մեջ և տաք պահեք 1 ժամ։Մյուս մասը պահվել է -20°C սառնարանում 1 ժամ։Երբ ժամանակը սպառվում է, հեռացրեք երկու նմուշները էլեկտրոֆորեզի համար:Էլեկտրաֆորեզի ավարտից հետո համեմատեք երկուսի էլեկտրոֆորեզային շերտերը:Եթե երկուսի շերտերը համահունչ են կամ զգալի տարբերություն չունեն (իհարկե, դրանց շերտերը նույնպես համապատասխանում են 2-րդ մեթոդի պայմաններին), դա նշանակում է, որ ՌՆԹ լուծույթում մնացորդային RNase աղտոտվածություն չկա, և ՌՆԹ-ի որակը շատ լավ է:Ընդհակառակը, եթե 70°C-ում ինկուբացված նմուշը ցույց է տալիս ակնհայտ դեգրադացիա, դա ցույց է տալիս, որ ՌՆԹ լուծույթում կա RNase աղտոտվածություն:
2 ՌՆԹ արդյունահանման փորձարարական մեթոդներ և տեխնիկա
Խնդիրները, որոնց մենք հաճախ հանդիպում ենք ՌՆԹ-ի արդյունահանման ժամանակ, հետևյալն են. (1) ՌՆԹ-ի ստացումը ցածր է.(2) ՌՆԹ-ն աղի լուրջ աղտոտվածություն ունի.(3) ՌՆԹ-ն ունի լուրջ օրգանական լուծիչներով աղտոտվածություն.(4) նմուշի դեգրադացիա և այլ խնդիրներ
1. Ընդհանուր օգտագործվող ընդհանուր ՌՆԹ արդյունահանման ռեակտիվներ
Գուանիդինի իզոթիոցիանատի մեթոդը և Տրիզոլ մեթոդը կենդանիների հյուսվածքներից և կենդանական բջիջներից ընդհանուր ՌՆԹ-ի արդյունահանման ամենատարածված մեթոդներն են:Այն հատկապես հարմար է փոքր նմուշների և հյուսվածքների համար, որոնք առանձնապես դժվար է արդյունահանվել, օրինակ՝ նապաստակի մաշկից և կենդանիների միացնող հյուսվածքից ընդհանուր ՌՆԹ-ի արդյունահանումը;Բացի այդ, Trizol-ը, որպես ընդհանուր նշանակության լիզի ռեագենտ, կարող է օգտագործվել նաև բույսերի հյուսվածքների, բակտերիաների, սնկերի և այլ հյուսվածքների արդյունահանման համար:Բուսական հյուսվածքների համար, որոնք պարունակում են պոլիսախարիդներ և պոլիֆենոլներ, ինչպիսիք են camellia oleifera-ն, թեյի տերևները, ռապևի սերմերը և այլն, CTAB մեթոդը կարող է օգտագործվել նաև ընդհանուր ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար:
Որպես սովորական մեթոդ, երկսյունակ մեթոդը նույնպես շատ տարածված է իր բնականոն ջերմաստիճանի աշխատանքի, RNase ավելացնելու անհրաժեշտության և անվտանգության պատճառով՝ առանց քլորոֆորմի, ֆենոլների և արդյունահանման այլ օրգանական ռեակտիվների:(առաջարկվող ապրանքներ )
2. Ընդհանուր ՌՆԹ-ի արդյունահանում կենդանիների հյուսվածքներից
(1) Փորձեք ընտրել թարմ անձեռոցիկ, եթե այն թարմ չէ (ցանկալի է երեք ամսվա ընթացքում՝ 80 ℃ սառնարան կամ սառեցված հեղուկ ազոտի մեջ։ Հյուսվածքը կտրելիս մի կտրեք անմիջապես սենյակային ջերմաստիճանում, անպայման դրեք սառցե տուփի վրա, աշխատեք խուսափել կրկնակի սառչելուց և հալվելուց։
(2) Օգտագործեք մաքուր մկրատ և պինցետ՝ կտորի փոքր կտոր կտրելու համար, փորձեք կտրել հյուսվածքի կենտրոնական մասը նմուշը կտրելիս կամ նախ կտրեք հյուսվածքի մեծ կտորը մեջտեղից, այնուհետև նմուշը կտրեք թարմ կտրվածքի դիրքում:Հեռացված հյուսվածքը պետք է ամբողջությամբ մանրացնել, մանրացված հյուսվածքը դնել EP խողովակի մեջ առանց RNase, ավելացնել լիզատը, մանրացված հյուսվածքը պետք է ամբողջությամբ ենթարկվի լիզատին և պատրաստվի համասեռացման:
(3) Նորմալ հյուսվածքների համար միասեռացման համար ընտրեք մունգ լոբի չափի հյուսվածքներ (30-60 մգ):Եթե հյուսվածքները պարունակում են մեծ քանակությամբ սպիտակուց, ճարպ կամ խիտ մանրաթելային հյուսվածքներ, ինչպիսիք են լյարդը, համապատասխանաբար ավելացրեք կամ նվազեցրեք կտրված հյուսվածքների քանակը (ըստ ցանկության) Ընտրեք 10-20 մգ):
(4) Եթե ձկան մկանները, ծովախեցգետնի միսը, մեդուզան և ջրի բարձր պարունակությամբ այլ հյուսվածքներ են արդյունահանվում, նմուշի ծավալը պետք է պատշաճ կերպով մեծացվի (խորհուրդ է տրվում 100-200 մգ):
(5) Եթե պայմանները թույլ են տալիս, կենդանական հյուսվածքը կարող է ուղղակիորեն արդյունահանվել բարձր անցումային հյուսվածքների համասեռացուցիչով համասեռացումից հետո, եթե այդպիսի սարքավորում չկա։
(6) Վերջնական արդյունահանումից հետո ստացված ՌՆԹ-ն պետք է անմիջապես դրվի սառցե տուփի վրա՝ ՌՆԹ-ի քայքայումը նվազեցնելու համար:
3. Կենդանական բջիջների ՌՆԹ-ի արդյունահանում
(1) Կասեցման բջիջները. ուղղակիորեն ցենտրիֆուգեք և դեն նետեք միջավայրը, լվացեք ստերիլ PBS-ով 1-2 անգամ, այնուհետև կասեցրեք համապատասխան քանակությամբ PBS-ով և այնուհետև ավելացրեք լիզատ՝ լիզիզի համար:Մի ավելացրեք լիզատը անմիջապես նստվածքային բջիջներին հեղուկն ամբողջությամբ հեռացնելուց հետո:Դա կհանգեցնի նրան, որ արտաքին շերտի լուծված բջիջներից հետո ազատված հիստոնային փաթեթը կպչունանա նստվածքային բջիջների արտաքին կողմին՝ դրանով իսկ սահմանափակելով գնդիկի ներսում գտնվող բջիջների շփումը լիզատի հետ:, ինչը հանգեցնում է բջիջների թերի լիզի և ՌՆԹ-ի նվազման։
(2) Բջիջներ, որոնք կիսակպչուն են կամ ամուր չեն կպչում. Միջավայրը դեն նետելուց հետո լվացեք PBS-ով 1-2 անգամ, այնուհետև ուղղակիորեն կլանեք համապատասխան քանակությամբ PBS և կուլտուրայի ափսեը պիպետտով կամ ատրճանակով փչեք՝ բջիջները փչելու համար և տեղափոխեք դրանք ՌՆԹ-ից զերծ բջիջներ:Լիզատը ավելացրեք ֆերմենտի EP խողովակին՝ արդյունահանման համար:
(3) Կպչուն բջիջները. նախ անհրաժեշտ է մարսել տրիպսինով, այնուհետև հավաքել RNase-ից զերծ EP խողովակներում, ցենտրիֆուգվել՝ վերը նշվածը հեռացնելու համար, 1-2 անգամ լվանալ PBS-ով, որպեսզի հեռացվի ավելորդ տրիպսինը և կրկին կասեցվեն համապատասխան քանակությամբ PBS-ով, այնուհետև անցեք արդյունահանման քայլին:
4. Բույսերի ՌՆԹ արդյունահանում
Բույսերի հյուսվածքները հարուստ են ֆենոլային միացություններով կամ հարուստ են պոլիսաքարիդներով կամ պարունակում են որոշ չբացահայտված երկրորդական մետաբոլիտներ կամ ունեն RNase-ի բարձր ակտիվություն։Այս նյութերը բջիջների լիզումից հետո սերտորեն միացվում են ՌՆԹ-ի հետ՝ առաջացնելով չլուծվող բարդույթներ կամ կոլոիդային նստվածքներ, որոնք դժվար է հեռացնել:Հետեւաբար, երբ մենք արդյունահանում ենք բույսերի հյուսվածքը, մենք պետք է ընտրենք բույսերի համար նախատեսված հավաքածու:Հավաքածուի լիզատը կարող է արդյունավետորեն լուծել պոլիֆենոլների հեշտ օքսիդացման և պոլիսախարիդային միացությունների և նուկլեինաթթուների տարանջատման խնդիրները:
(Պոլիսաքարիդային պոլիֆենոլի բույսի ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար առաջարկվող արտադրանքները.
(1) Բույսի կեղևը, միջուկը, սերմերը, տերևները և այլն պետք է ամբողջությամբ աղալ հավանգի մեջ:Հղկման գործընթացում հեղուկ ազոտը պետք է ժամանակին համալրվի՝ նմուշը չհալեցնելու համար:Աղացած նմուշը պետք է արագ ավելացվի լիզատի մեջ և թափահարվի՝ ՌՆԹ-ի քայքայումից խուսափելու համար:
(2) Մանրաթելերով հարուստ նմուշների համար, ինչպիսիք են բրնձի և ցորենի տերևները, արդյունահանման քանակը պետք է համապատասխանաբար կրճատվի, հակառակ դեպքում հյուսվածքների մանրացումը և լիզումը ամբողջական չեն լինի, ինչը կհանգեցնի արդյունահանվող ՌՆԹ-ի ցածր եկամտաբերությանը:
(3) Ջրի բարձր պարունակությամբ բույսերի հյուսվածքների համար, ինչպիսիք են նռան պտուղը, ձմերուկի պտուղը, դեղձի պտուղը և այլն, նմուշի չափը պետք է համապատասխանաբար մեծացվի (100-200 մգ պարտադիր չէ):
(4) Բույսերի հյուսվածքներին, ինչպիսիք են բույսերի տերևները, կոճղարմատները, կոշտ մրգերը և այլ նյութեր, սովորաբար խորհուրդ է տրվում օգտագործել հեղուկ ազոտ՝ բաղադրիչները հավանգի մեջ մանրակրկիտ հալեցնելու համար, այնուհետև անցնել արդյունահանման քայլին:Հյուսվածքների սովորական հոմոգենիզատորները կարող են արդյունավետ չլինել բույսերի հյուսվածքների համասեռացման համար և, ընդհանուր առմամբ, խորհուրդ չեն տրվում:
5. ՌՆԹ արդյունահանման նախազգուշական միջոցներ
(1) Հյուսվածքների նմուշները պետք է լինեն հնարավորինս թարմ, որպեսզի խուսափեն կրկնակի սառեցումից և հալվելուց:
(2) Հյուսվածքը պետք է ամբողջությամբ մանրացված լինի արդյունահանման ժամանակ, և հյուսվածքի քանակը չպետք է շատ քիչ լինի, էլ չասած շատ:
(3) Բավարար ինկուբացիոն ժամանակ պետք է տրվի լիզատը ավելացնելուց հետո, որպեսզի նմուշն ամբողջությամբ լուծվի:
(4) Տրիզոլ մեթոդը արդյունահանման համար օգտագործելիս շերտավորումից հետո գերնույն նյութը կլանելու սկզբունքն է «նախընտրում եմ ավելի քիչ ներշնչել, քան ավելի շատ ներշնչել», և չպետք է արդյունահանվի միջին շերտ, հակառակ դեպքում դա կառաջացնի գենոմային ԴՆԹ-ի լուրջ աղտոտում:
(5) Լվացքի ժամանակ լվացքի հեղուկը պետք է ամբողջությամբ ներթափանցի խողովակի պատի շուրջ, որպեսզի ապահովի մանրակրկիտ լվացումը:
(6) Սյունակի արդյունահանման մեթոդի համար, բացի սյունը լվանալուց հետո անջատելուց, կլանման սյունը պետք է տեղադրվի նաև ծայրահեղ մաքուր նստարանի մեջ և փչվի 5-10 րոպե, որպեսզի օրգանական լուծիչը ամբողջությամբ գոլորշիացվի մինչև չորանա:
(7) Սյունակի մեթոդի վերջին զտման ժամանակ, DEPC ջուր ավելացնելուց հետո, այն պետք է ինկուբացվի 3-5 րոպե, կամ DEPC-ի ջուրը պետք է նախապես տաքացվի մինչև 60°C, որպեսզի բարձրացվի լուծույթի ելքը:Ավանդական տրիզոլի տարանջատման և իզոպրոպանոլի տեղումների մեթոդում վերջնական ՌՆԹ-ն լուծվում է DEPC ջրի մեջ, ուստի պետք է համապատասխան ժամանակ տրամադրվի տարրալուծման համար, և ցենտրիֆուգային խողովակի հատակը պետք է շարունակաբար փչվի պիպետտի ծայրով:
3 Տhree ՌՆԹ-ի ցածր կոնցենտրացիայի/վատ որակի պատճառներ և լուծումներ
1. Բերքատվությունը չափազանց ցածր է
Արդյունահանված նմուշը չափազանց ցածր է, ընդհանուր քանակությունը անբավարար է, կամ արդյունահանված նմուշը չափազանց շատ է, և լիզը ամբողջական չէ.համապատասխան որակի հյուսվածքը կամ բջիջները պետք է օգտագործվեն արդյունահանման համար, նմուշի նախնական մշակումը պետք է լավ կատարվի, և լիզը պետք է բավարար լինի:
2. Գենոմի մնացորդներ
Տրիզոլ մեթոդով արդյունահանման ժամանակ, երբ շերտավորումից հետո վերին նյութը ներծծվում է միջին շերտ, առաջանում է գենոմի լուրջ աղտոտում.Շերտավորելիս պետք է լրացուցիչ զգույշ լինել՝ միջին շերտը ծծելուց խուսափելու համար:Եթե արդյունահանման համար օգտագործվում է սյունակի մեթոդը, ապա արդյունահանման համար կարելի է ընտրել DNase I պարունակող հավաքածու:Թաղանթի վրա ներծծված նուկլեինաթթուն ուղղակիորեն մարսվում է DNase I-ով, ինչը կարող է մեծապես նվազեցնել ԴՆԹ-ի մնացորդները:
3. ՌՆԹ-ի քայքայումը
Դա կարող է լինել հենց արդյունահանված նմուշի քայքայումը կամ արդյունահանման գործընթացում առաջացած քայքայումը.որքան հնարավոր է, թարմ նմուշները պետք է օգտագործվեն ՌՆԹ-ի արդյունահանման համար, և հավաքված նմուշները պետք է ժամանակին պահվեն հեղուկ ազոտի կամ -80°C սառնարանում, և պետք է խուսափել կրկնվող սառեցումից և հալվելուց:ՌՆԱզ/ԴՆազազերծ ծայրեր, ցենտրիֆուգային խողովակներ և այլ նյութեր պետք է օգտագործվեն ՌՆԹ-ի արդյունահանման գործընթացում:Արդյունահանման գործընթացը պետք է լինի հնարավորինս արագ:Արդյունահանված ՌՆԹ-ն պետք է տեղադրվի սառցե տուփի վրա և պահվի ժամանակին -80-ում:Եթե արդյունահանված ՌՆԹ-ն պետք է հայտնաբերվի գելային էլեկտրոֆորեզով, էլեկտրոֆորեզը պետք է կատարվի արդյունահանումից անմիջապես հետո, իսկ էլեկտրոֆորեզի բուֆերը փոխարինվի նոր պատրաստվածով:
4. Աղի և օրգանական լուծիչների մնացորդներ
Էքստրակցիոն ռեակտիվները պարունակում են ֆենոլի և գուանիդինի աղեր, իսկ լվացման լուծույթը՝ էթանոլ։Արդյունահանման գործընթացի ընթացքում լիզատը ամբողջությամբ չի ներծծվել և չի հեռացվել, իսկ լվացման լուծույթը ամբողջությամբ չի չորացել:Մնացորդային աղերը և օրգանական լուծիչները վնասակար են հետագա հակադարձ արտագրման և ՊՇՌ-ի համար:Արգելափակման տարբեր աստիճաններ, ուստի արդյունահանման գործընթացում հյուսվածքների լիզատը պետք է ամբողջությամբ հեռացվի, իսկ լվացումը պետք է բավարար լինի, որպեսզի խողովակի շրջակա պատերը հնարավոր լինի լվանալ:Բացի այդ, խողովակը դատարկվում և փչում է անհրաժեշտ քայլ, որն էլ ավելի կնվազեցնի օրգանական նյութերի մնացորդները:
ՌՆԹ արդյունահանման մասին լրացուցիչ տեղեկությունների համար խնդրում ենք հետևել մեր կայքին.
Լրացուցիչ տեղեկությունների համար www.foreivd.com:
Հրապարակման ժամանակը՝ Dec-01-2022
