1. Նախնական ըմբռնում

Այս փուլում մենք պետք է հասկանանք որոշ հասկացություններ և տերմինաբանություն, որպեսզի խուսափենք մեր տարեցների առջև սխալներ թույլ տալուց, ինչպիսիք են.

Q: Ո՞րն է տարբերությունը RT-PCR-ի, qPCR-ի, իրական ժամանակի PCR-ի և իրական ժամանակի RT-PCR-ի միջև:

Պատասխան. RT-PCR-ն հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR է(հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR, RT-PCR), որը պոլիմերազային շղթայական ռեակցիայի (ՊՇՌ) լայնորեն կիրառվող տարբերակ է։RT-PCR-ում ՌՆԹ-ի շղթան հակադարձ տառադարձվում է կոմպլեմենտար ԴՆԹ-ի, որն այնուհետև օգտագործվում է որպես ՊՇՌ-ով ԴՆԹ-ի ուժեղացման ձևանմուշ:
Իրական ժամանակում-PCR և qPCR(Քանակական Rea-ltime-PCR) նույն բանն է, երկուսն էլ իրական ժամանակի քանակական PCR են, ինչը նշանակում է, որ PCR-ի յուրաքանչյուր ցիկլ ունի իրական ժամանակի տվյալների գրառումներ, ուստի մեկնարկային ձևանմուշների քանակը կարող է ճշգրտվել ճշգրիտ վերլուծության վրա:

Թեև և իրական ժամանակի PCR (իրական ժամանակի ֆլուորեսցենտային քանակական PCR) և Reverse transcription PCR (հակադարձ տրանսկրիպցիոն PCR) կարծես կրճատված են որպես RT-PCR, միջազգային կոնվենցիան հետևյալն է.PCR, իրական ժամանակի PCR-ն ընդհանուր առմամբ կրճատվում է որպես qPCR (քանակական իրական ժամանակի PCR).

Իսկ իրական ժամանակի RT-PCR (RT-qPCR), դա հակադարձ տառադարձման PCR-ն է՝ համակցված լյումինեսցենտային քանակական տեխնոլոգիայի հետ։Սկզբում ստացեք cDNA (RT) ՌՆԹ հակադարձ տրանսկրիպցիայից, այնուհետև օգտագործեք Real-time PCR քանակական վերլուծության համար (qPCR):Լաբորատորիաների մեծ մասը կատարում է RT-qPCR, այսինքն՝ հետազոտություն ՌՆԹ-ի արտահայտման նվազ կարգավորման վերաբերյալ, ուստի qPCR-ն, որի մասին բոլորը խոսում են լաբորատորիայում, իրականում վերաբերում է RT-qPCR-ին, բայց մի մոռացեք, որ դեռևս կան բազմաթիվ ԴՆԹ թեստեր կլինիկական կիրառություններում:Քանակական վերլուծություն, ինչպիսին է հեպատիտ B վիրուսի HBV հայտնաբերումը:

Հարց. Լյումինեսցենտային քանակական PCR-ն շատ կարդալուց հետո ինչո՞ւ պետք է ուժեղացված հատվածը վերահսկվի 80-300bp միջակայքում:

ՊատասխանելՅուրաքանչյուր գենի հաջորդականության երկարությունը տարբեր է, ոմանք մի քանի կբ են, ոմանք՝ հարյուրավոր bp, բայց մենք միայն պետք է պահանջենք, որ արտադրանքի երկարությունը լինի 80-300 bp, երբ նախագծում ենք պրայմերներ, որոնք շատ կարճ կամ չափազանց երկար են, որոնք հարմար չեն լյումինեսցենտային քանակական PCR հայտնաբերման համար:Արտադրանքի բեկորը չափազանց կարճ է այբբենարան-դիմերից տարբերվելու համար:Պրայմեր-դիմերի երկարությունը մոտ 30-40 բ/պ է, և դժվար է տարբերակել՝ այն այբբենարան-դիմեր է, թե արտադրանք, եթե այն 80 բ/պ-ից պակաս է:Եթե ​​արտադրանքի բեկորը չափազանց երկար է, գերազանցում է 300 bp-ը, դա հեշտությամբ կհանգեցնի ուժեղացման ցածր արդյունավետության և չի կարող արդյունավետորեն հայտնաբերել գենի քանակը:

Օրինակ, երբ հաշվում ես, թե քանի հոգի կա դասարանում, պետք է միայն հաշվել, թե քանի բերան կա:Նույնը ճիշտ է, երբ դուք հայտնաբերում եք գեներ, դուք միայն պետք է հայտնաբերեք գենի որոշակի հաջորդականություն, որպեսզի ներկայացնեք ամբողջ հաջորդականությունը:Եթե ​​ցանկանում եք հաշվել մարդկանց, պետք է հաշվեք և՛ բերանները, և՛ քիթերը, և՛ ականջները, և՛ ակնոցները, և հեշտ է սխալվել:

Ընդլայնելու համար, կենսաբանական հետազոտություններում կան բազմաթիվ հետազոտական ​​դեպքեր կետից տարածք, քանի որ ցանկացած տեսակի գեների հաջորդականությունը շատ երկար է, անհրաժեշտ չէ և անհնար է չափել բոլոր բեկորները, օրինակ՝ բակտերիաների 16S հաջորդականությունը, որը բակտերիաների պահպանողական հաջորդականության փորձարկումն է՝ պարզելու բակտերիաների որոշակի պոպուլյացիայի թիվը:

Q: Ո՞րն է qPCR այբբենարանի նախագծման օպտիմալ երկարությունը:

ՊատասխանելԸնդհանուր առմամբ, այբբենարանի երկարությունը մոտ 20-24 bp է, ինչը ավելի լավ է:Իհարկե, մենք պետք է ուշադրություն դարձնենք այբբենարանի TM արժեքին այբբենարանի նախագծման ժամանակ, քանի որ դա կապված է եռացման օպտիմալ ջերմաստիճանի հետ:Բազմաթիվ փորձերից հետո ապացուցվել է, որ 60°C-ն ավելի լավ TM արժեք է:Եթե ​​եռացման ջերմաստիճանը չափազանց ցածր է, դա հեշտությամբ կհանգեցնի ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման:Եթե ​​եռացման ջերմաստիճանը չափազանց բարձր է, ուժեղացման արդյունավետությունը կլինի համեմատաբար ցածր, ուժեղացման կորի գագաթնակետը կսկսվի ավելի ուշ, և CT արժեքը կհետաձգվի:

Հարց. Ինչպե՞ս է ներկման մեթոդը տարբերվում զոնդի մեթոդից:

Պատասխան՝ Ներկման մեթոդՈրոշ լյումինեսցենտային ներկեր, ինչպիսիք են SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO և այլն, ինքնուրույն լույս չեն արձակում, բայց երկշղթա ԴՆԹ-ի փոքր ակոսին միանալուց հետո լույս են արձակում:Հետևաբար, PCR ռեակցիայի սկզբում մեքենան չի կարող հայտնաբերել լյումինեսցենտային ազդանշանը:Երբ ռեակցիան հասնում է եռացման-ընդլայնման փուլին, կրկնակի շարանը բացվում է, և ԴՆԹ պոլիմերազի ազդեցությամբ սինթեզվում է նոր շղթա, և լյումինեսցենտային մոլեկուլը կապվում է dsDNA փոքր ակոսին։Քանի որ PCR ցիկլերի թիվը մեծանում է, ավելի ու ավելի շատ ներկեր են զուգակցվում երկշղթա ԴՆԹ-ի հետ, և լյումինեսցենտային ազդանշանը նույնպես անընդհատ ուժեղանում է:Ներկանյութի մեթոդը հիմնականում կիրառվում է գիտական ​​հետազոտություններում։
Հ.Գ. Փորձարկում կատարելիս զգույշ եղեք, ներկը պետք է զուգակցվի մարդու ԴՆԹ-ի հետ, զգույշ եղեք, որ այն վերածվի լյումինեսցենտ մարդու:

Ներկման մեթոդ (ձախ) Զոնդի մեթոդ (աջ)
Հ.Գ. Փորձարկում կատարելիս զգույշ եղեք, ներկը պետք է զուգակցվի մարդու ԴՆԹ-ի հետ, զգույշ եղեք, որ այն վերածվի լյումինեսցենտ մարդու:

SYBR Green Ⅰ կապվում է ԴՆԹ-ի փոքր ակոսին

Զոնդի մեթոդTaqman զոնդը ամենաշատ օգտագործվող հիդրոլիզի զոնդն է:Զոնդի 5′ վերջում կա լյումինեսցենտային խումբ, սովորաբար FAM, և զոնդն ինքնին հանդիսանում է թիրախային գենին լրացնող հաջորդականություն:3′ վերջում կա լյումինեսցենտային մարման խումբ:Ֆլյուորեսցենտային ռեզոնանսային էներգիայի փոխանցման սկզբունքի համաձայն (Förster-ի ռեզոնանսային էներգիայի փոխանցում, FRET), երբ հաղորդող լյումինեսցենտային խումբը (դոնոր ֆլուորեսցենտային մոլեկուլ) և մարող լյումինեսցենտ խումբը (ընդունող լյումինեսցենտային մոլեկուլ) գրգռվում են, երբ սպեկտրը համընկնում է (7-1-ի չափի հեռավորությունը) ընդունող մոլեկուլի ֆլյուորեսցենտությունը, մինչդեռ ավտոֆլյորեսցենտությունը թուլանում է։Հետևաբար, PCR ռեակցիայի սկզբում, երբ զոնդը համակարգում ազատ է և անձեռնմխելի, ռեպորտաժային լյումինեսցենտային խումբը չի արտանետի ֆլյուորեսցենտ:Կառուցելիս այբբենարանը և զոնդը կապվում են կաղապարին:Ընդլայնման փուլում պոլիմերազը շարունակաբար սինթեզում է նոր շղթաներ։ԴՆԹ պոլիմերազը ունի 5'-3' էկզոնուկլեազային ակտիվություն:Զոնդին հասնելիս ԴՆԹ պոլիմերազը կհիդրոլիզացնի զոնդը կաղապարից, կառանձնացնի ռեպորտաժային լյումինեսցենտային խումբը մարող ֆլուորեսցենտային խմբից և կթողարկի լյումինեսցենտային ազդանշանը:Քանի որ կա զոնդի և կաղապարի միջև մեկ առ մեկ հարաբերություն, զոնդի մեթոդը թեստի ճշգրտության և զգայունության առումով գերազանցում է ներկման մեթոդին:Ախտորոշման ժամանակ հիմնականում կիրառվում է զոնդավորման մեթոդը։

Հարց: Ի՞նչ է բացարձակ քանակականացումը:Ի՞նչ է հարաբերական քանակականացումը:

ՊատասխանելԲացարձակ քանակականացումը վերաբերում է qPCR-ով փորձարկվող նմուշի սկզբնական պատճենի թվի հաշվարկին, օրինակ, թե քանի HBV վիրուս կա 1 մլ արյան մեջ:Հարաբերական քանակականացման արդյունքում ստացված արդյունքը որոշակի նմուշում թիրախային գենի քանակի փոփոխությունն է մեկ այլ տեղեկատու նմուշի համեմատ, և գենի արտահայտությունը կարգավորվում է կամ նվազում:

Հարց. Արդյո՞ք ՌՆԹ-ի արդյունահանման քանակը, հակադարձ տառադարձման արդյունավետությունը և ուժեղացման արդյունավետությունը կազդեն փորձարարական արդյունքների վրա:
Հարց. Արդյո՞ք նմուշների պահպանումը, արդյունահանման ռեակտիվները, հակադարձ տառադարձման ռեակտիվները և լույս փոխանցող սպառվող նյութերը կազդե՞ն փորձարարական արդյունքների վրա:
Հարց: Ո՞ր մեթոդը կարող է ուղղել փորձարարական տվյալները:

Ինչ վերաբերում է այս խնդիրներին, մենք դրանք մանրամասն կներկայացնենք ստորև ներկայացված ընդլայնված և առաջադեմ բաժիններում:
2. Ընդլայնված գիտելիքներ

Ինչ վերաբերում է իրական ժամանակի ֆլուորեսցենտային քանակական PCR-ին, մենք պետք է ճանաչենք այն իրողությունը, որ ամեն տարի հրապարակվում են հազարավոր գիտահետազոտական ​​հոդվածներ, որոնց թվում քիչ թիվ չէ լյումինեսցենտային քանակական PCR տեխնոլոգիան:

Եթե ​​չկա լյումինեսցենտային քանակական PCR փորձի չափման ընդհանուր ստանդարտ, արդյունքները կարող են շատ տարբեր լինել:Նույն տեսակի նույն գենի համար, նույն մշակման մեթոդով, հայտնաբերման արդյունքները նույնպես շատ տարբեր կլինեն, և ուշացածների համար դժվար կլինի կրկնել նույն արդյունքները:Դուք ոչ ոք չգիտի, թե որն է ճիշտ և որը սխալ:

Արդյո՞ք սա նշանակում է, որ լյումինեսցենտային քանակական PCR-ն խաբեության տեխնոլոգիա է, թե՞ անվստահելի տեխնոլոգիա:Ոչ, դա պայմանավորված է նրանով, որ լյումինեսցենտային քանակական PCR-ն ավելի զգայուն և ճշգրիտ է, և մի փոքր սխալ գործողությունը լիովին հակառակ արդյունք կտա:Փոքր կորուստը հազար մղոն հեռավորության վրա է.Հոդվածի հեղինակը կարող է կրկնակի խոշտանգումների ենթարկվել գրախոսների կողմից։Միևնույն ժամանակ, ամսագրի գրախոսներին նույնպես դժվար է ընտրել տարբեր փորձարարական արդյունքներից:

Ընդհանուր առմամբ, մատնանշելով իրական ժամանակի PCR փորձարկումներում կոնսենսուսի բացակայությունը:Այդ նպատակով արդյունաբերության ավագ գիտնականները սկսեցին ձևակերպել ստանդարտներ.պահանջելով, որ մասնակիցները ներկայացնեն որոշ անհրաժեշտ փորձարարական և տվյալների մշակման մանրամասներ (ներառյալ անհրաժեշտ տվյալները) հոդվածում՝ այս չափանիշներին համապատասխանելու համար:

Գրախոսները կարող են դատել փորձի որակը՝ կարդալով այս մանրամասները.ապագա ընթերցողները կարող են սա օգտագործել նաև փորձը կրկնելու կամ փորձը բարելավելու համար:Այնուհետև այս կերպ ստացված փորձարարական արդյունքները լի են տեղեկատվական, բարձրորակ և օգտագործելի։

MIBBI (Նվազագույն տեղեկատվություն կենսաբանական և կենսաբժշկական հետազոտությունների համար -http://www.mibbi.org) առաջացել է։MIBBI-ն նախագիծ է, որն ապահովում է փորձերի ստանդարտներ.Այն տպագրվում է բնության մեջ։Այս նախագիծը ուղղված է տարբեր կենսաբանական փորձերի, ներառյալ բջջային կենսաբանությունը, Microarray, qPCR, որը մենք պատրաստվում ենք քննարկել հիմա և այլն, և նախատեսում է յուրաքանչյուր տեսակի փորձ՝ ձեռագրեր ներկայացնելիս:Այդ տեղեկատվությունը պետք է միշտ տրամադրվի:

MIBBI նախագծում կան երկու հոդվածներ, որոնք վերաբերում են լյումինեսցենտային քանակական PCR-ին, մասնավորապես.:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – կառուցվածքային լեզու և հաշվետվությունների ուղեցույց իրական ժամանակի քանակական PCR տվյալների համար;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – նվազագույն տեղեկատվություն իրական ժամանակում քանակական PCR փորձերի մասին հոդվածներ հրապարակելու համար:
Նախ, եկեք խոսենք RDML-ի, տերմինաբանության հստակեցման մասին:

Եթե ​​ամեն ինչի համար չկա ստանդարտ սահմանում, ապա անհնար է շարունակել քննարկումը, ինչի պատճառով էլ տերմինների բացատրությունն այդքան կարևոր է քննության մեջ։
Լյումինեսցենտային քանակական PCR փորձի մեջ օգտագործվող տերմինաբանությունը ներառում է հետևյալ բովանդակությունը.QIAGEN-ը մեզ համար արել է լավագույն ամփոփումը։Հետևյալները բոլորը չոր ենապրանք .

Ուժեղացման կոր
Ուժեղացման կորը վերաբերում է ՊՇՌ գործընթացի ընթացքում կազմված կորին, որի ցիկլի թիվը որպես աբսցիսսա և իրական ժամանակի ֆլուորեսցենտային ինտենսիվությունը ռեակցիայի ընթացքում որպես օրդինատ:

Գերազանց ուժեղացման կորը պետք է ունենա հետևյալ բնութագրերըելակետային գիծը հարթ է կամ փոքր-ինչ նվազել, և ակնհայտ աճի միտում չկա.կորի թեքման կետը պարզ է, իսկ էքսպոնենցիալ փուլի թեքությունը համաչափ է ուժեղացման արդյունավետությանը:Որքան մեծ է թեքությունը, այնքան բարձր է ուժեղացման արդյունավետությունը.ուժեղացման ընդհանուր կորը Զուգահեռությունը լավ է, ինչը ցույց է տալիս, որ յուրաքանչյուր խողովակի ուժեղացման արդյունավետությունը նման է.ակնհայտ է ցածր կոնցենտրացիայի նմուշների ուժեղացման կորի էքսպոնենցիալ փուլը:

Ելակետային (բազային)
Ելակետը վաղ շրջանի աղմուկի մակարդակն է, սովորաբար չափվում է 3-րդ և 15-րդ ցիկլերի միջև, քանի որ ուժեղացման արտադրանքի հետևանքով առաջացած ֆլուորեսցենտային արժեքի աճը չի կարող հայտնաբերվել այս ժամանակահատվածում:Բազային գիծը հաշվարկելու համար օգտագործվող ցիկլերի քանակը կարող է տարբեր լինել և կարող է անհրաժեշտ լինել նվազեցնել, եթե օգտագործվում են կաղապարի մեծ քանակություններ կամ եթե թիրախ գենի արտահայտման մակարդակը բարձր է:

Ելակետային գիծը սահմանելու համար անհրաժեշտ է դիտել ֆլուորեսցենտային տվյալները գծայինության ուժեղացման կորից:Ելակետային գիծը դրված է այնպես, որ ուժեղացման կորի աճը սկսվի ցիկլի համարով, որն ավելի մեծ է, քան բազային ցիկլի վերին թիվը:Ելակետային գծերը պետք է սահմանվեն անհատապես յուրաքանչյուր թիրախային հաջորդականության համար:Վաղ ցիկլերում հայտնաբերված միջին ֆլուորեսցենտային արժեքները պետք է հանվեն ուժեղացված արտադրանքներում ստացված ֆլուորեսցենտային արժեքներից:Իրական ժամանակի տարբեր PCR ծրագրերի վերջին տարբերակները թույլ են տալիս ավտոմատ կերպով օպտիմալացնել ելակետային պարամետրերը առանձին նմուշների համար:

PCR ուժեղացման ռեակցիայի առաջին մի քանի ցիկլերի ընթացքում ֆլյուորեսցենտային ազդանշանը շատ չի փոխվում:Ուղիղ գծին մոտենալը կոչվում է բազային, բայց եթե ուշադիր նայենք առաջին մի քանի ցիկլերին, կտեսնենք, որ բազային գծի ներսում այն ​​է, ինչ տեղի է ունենում ստորև նկարում:

Նախապատմություն Նախապատմությունը վերաբերում է
ռեակցիայի ոչ հատուկ ֆլուորեսցենտային արժեքը:Օրինակ՝ անարդյունավետ ֆլուորեսցենտային մարում;կամ մեծ թվով կրկնակի շղթա ԴՆԹ կաղապարներ՝ շնորհիվ SYBR Green-ի օգտագործման:Ազդանշանի ֆոնային բաղադրիչները մաթեմատիկորեն հեռացվում են Real-Time PCR ծրագրային ալգորիթմի միջոցով:

Լրագրողի ազդանշան
Ռեպորտաժի ազդանշանը վերաբերում է լյումինեսցենտային ազդանշանին, որը գեներացվում է SYBR Green-ի կամ լյումինեսցենտով պիտակավորված հաջորդականության հատուկ զոնդերի կողմից իրական ժամանակում PCR-ի ժամանակ:

Նորմալացված ռեպորտաժի ազդանշան (RN)
RN-ն վերաբերում է ռեպորտաժային ներկի ֆլյուորեսցենտային ինտենսիվությանը, որը բաժանված է յուրաքանչյուր ցիկլում չափվող պասիվ հղման ներկի ֆլյուորեսցենտային ինտենսիվությանը:

Պասիվ տեղեկատու ներկ
Որոշ իրական ժամանակի PCR-ներում,ROX լյումինեսցենտային ներկը օգտագործվում է որպես ներքին հղում՝ լյումինեսցենտային ազդանշանը նորմալացնելու համար.Այն շտկում է տատանումները, որոնք պայմանավորված են ոչ ճշգրիտ խողովակաշարով, ջրհորի դիրքով և լյումինեսցենտային տատանումներով՝ հորատանցք առ հոր հիմունքներով:

Լյումինեսցենտային շեմ (շեմ)
ճշգրտվել է ֆոնային արժեքից բարձր և զգալիորեն ցածր ուժեղացման կորի սարահարթի արժեքից:Այն պետք է ընկած լինի ուժեղացման կորի գծային շրջանում՝ ներկայացնելով PCR-ի հայտնաբերման լոգ-գծային միջակայքը:Շեմերը պետք է սահմանվեն լոգարիթմական ուժեղացման կորի տեսքով, որպեսզի PCR-ի լոգ-գծային փուլը հեշտությամբ ճանաչելի լինի:Եթե ​​իրական ժամանակի PCR-ում կան բազմաթիվ թիրախային գեներ, ապա շեմը պետք է սահմանվի յուրաքանչյուր թիրախի համար:Ընդհանուր առմամբ, PCR ռեակցիայի առաջին 15 ցիկլերի ֆլյուորեսցենտային ազդանշանն օգտագործվում է որպես ֆլյուորեսցենտային ֆոնային ազդանշան, իսկ ֆլյուորեսցենտային շեմը 10 անգամ գերազանցում է PCR-ի առաջին 3-ից 15 ցիկլերի ֆլյուորեսցենտային ազդանշանի ստանդարտ շեղումը, իսկ PCR-ի ֆլյուորեսցենտային արագացման փուլը սահմանված է:Ընդհանուր առմամբ, յուրաքանչյուր գործիք ունի իր ֆլյուորեսցենտային շեմը, որը սահմանված է օգտագործելուց առաջ:

Ցիկլի շեմ (CT) կամ հատման կետ (CP)
Ցիկլը, որի ժամանակ ուժեղացման կորը հատում է շեմը (այսինքն՝ այն կետը, որտեղ ֆլուորեսցենտային հայտնաբերումը զգալիորեն մեծանում է):CT-ն կարող է լինել կոտորակ և կարող է հաշվարկվել մեկնարկային կաղապարի քանակը:CT արժեքը ներկայացնում է ցիկլերի քանակը, երբ յուրաքանչյուր PCR ռեակցիայի խողովակի լյումինեսցենտային ազդանշանը հասնում է սահմանված շեմին:Յուրաքանչյուր ձևանմուշի CT արժեքի և կաղապարի սկզբնական պատճենի համարի լոգարիթմի միջև կա գծային հարաբերություն.ավելի բարձր է սկզբնական պատճենի թիվը, այնքան փոքր է CT արժեքը և հակառակը.Ստանդարտ կորը կարող է կազմվել՝ օգտագործելով ստանդարտ՝ հայտնի սկզբնական պատճենի համարով, որտեղ աբսցիսան ներկայացնում է CT արժեքը, իսկ օրդինատը ներկայացնում է սկզբնական պատճենի համարի լոգարիթմը:Հետևաբար, քանի դեռ ստացվում է անհայտ նմուշի CT արժեքը, նմուշի սկզբնական պատճենի թիվը կարող է հաշվարկվել ստանդարտ կորից:

ΔCT արժեքը
ΔCT արժեքը նկարագրում էթիրախային գենի և համապատասխան էնդոգեն հղումային գենի CT արժեքի տարբերությունը, ինչպիսին է տնային տնտեսության գենը և օգտագործվում է օգտագործվող կաղապարի քանակը նորմալացնելու համար.
⇒ΔCT = CT (թիրախային գեն) – CT (էնդոգեն հղումային գեն)

ΔΔCT արժեքը
ΔΔCT արժեքը նկարագրում է հետաքրքրություն ներկայացնող նմուշի ΔΔCT արժեքի (օրինակ՝ գրգռված բջիջների) և հղումային նմուշի (օրինակ՝ չխթանված բջիջների) միջին ΔΔCT արժեքի տարբերությունը։Հղման նմուշը կոչվում է նաև տրամաչափման նմուշ, և բոլոր մյուս նմուշները նորմալացվում են դրան հարաբերական քանակականացման համար.
⇒ΔΔCT = միջին ΔCT (հետաքրքրության նմուշ) – միջին ΔCT (տեղեկատու նմուշ)

Էնդոգեն հղումային գեներ (էնդոգեն հղումային գեներ)
Էնդոգեն տեղեկատու գեների արտահայտման մակարդակները, ինչպիսիք են տնային տնտեսության գեները (տնային գեներ), չեն տարբերվում նմուշների միջև:Հղված գենի CT արժեքները թիրախային գենի հետ համեմատելը թույլ է տալիս թիրախ գենի արտահայտման մակարդակը նորմալացնել մուտքային ՌՆԹ-ի կամ cDNA-ի քանակին (տե՛ս վերը նշված ΔCT արժեքների բաժինը):

Ներքին հղումային գեները ճիշտ ենՌՆԹ-ի հնարավոր քայքայումը կամ ՌՆԹ-ի նմուշներում ֆերմենտների ինհիբիտորների առկայությունը, ինչպես նաև ՌՆԹ-ի պարունակության տատանումները, հակադարձ տառադարձման արդյունավետությունը, նուկլեինաթթվի վերականգնումը և նմուշների մշակումը:Օպտիմալ հղման գեն(ներ) ընտրելու համար մենք փոփոխել ենք ալգորիթմը, որպեսզի թույլ տա դրա ընտրությունը օպտիմալ հղում՝ կախված փորձարարական պարամետրից:

Ներքին հսկողություն
Վերահսկիչ հաջորդականություն, որն ուժեղացվում է նույն ռեակցիայի մեջ, ինչ թիրախային հաջորդականությունը և զոնդավորվում է այլ զոնդով (այսինքն՝ կատարում է դուպլեքս ՊՇՌ):Ներքին կառավարումը հաճախ օգտագործվում է ձախողված ուժեղացումները բացառելու համար, օրինակ, երբ թիրախային հաջորդականությունը չի հայտնաբերվում:
Calibration նմուշ
Հղման նմուշ (օրինակ՝ մաքրված ՌՆԹ-ն բջջային գծից կամ հյուսվածքից), որն օգտագործվում է հարաբերական քանակականացման մեջ՝ համեմատելու բոլոր մյուս նմուշները՝ որոշելու գենի հարաբերական արտահայտման մակարդակը:Ստուգաչափման նմուշը կարող է լինել ցանկացած նմուշ, բայց սովորաբար հսկիչ է (օրինակ՝ չմշակված նմուշ կամ փորձի զրոյական ժամանակի նմուշ):

Դրական վերահսկում
օգտագործել վերահսկման ռեակցիաներըկաղապարի հայտնի քանակությունները.Դրական հսկիչները հաճախ օգտագործվում են ստուգելու համար, թե արդյոք այբբենարանի կամ այբբենարան-զոնդերի հավաքածուն ճիշտ է աշխատում, և արդյոք ռեակցիան ճիշտ է տեղադրված:

Կաղապարի վերահսկում չկա (NTC)
Վերահսկիչ ռեակցիա, որը պարունակում է ուժեղացման ռեակցիայի բոլոր անհրաժեշտ բաղադրիչները, բացառությամբ կաղապարի, որը սովորաբար փոխարինվում է ջրով:NTC-ի օգտագործումը կարող է հայտնաբերել ռեագենտով աղտոտվածության կամ օտար ԴՆԹ-ի հետևանքով առաջացած աղտոտումը, այդպիսով ապահովելով հայտնաբերման տվյալների իսկությունն ու հավաստիությունը:NTC հսկողության ուժեղացումը ցույց է տալիս աղտոտվածություն:

RT հսկողություն չկա (NRT)
ՌՆԹ-ի արդյունահանման գործընթացը կարող է պարունակել մնացորդային գենոմային ԴՆԹ, որը չափազանց վնասակար է և հանդիսանում է տվյալների որակի վրա ազդող մեղավորը և qPCR-ի բնական թշնամին, ուստի փորձեր նախագծելիս այն պետք է նախագծված լինի միայն ՌՆԹ-ի հայտնաբերումը ուժեղացնելու համար:Երկու եղանակ կա՝ մեկը ինտրոնների միջով այբբենարանների ձևավորումն է, մյուսը՝ ԴՆԹ-ն ամբողջությամբ հեռացնելը, որն է ավելի լավը, որը կքննարկվի ավելի ուշ:NTR հսկողությունը կախարդական հայելի է ԴՆԹ-ի աղտոտվածությունը հայտնաբերելու համար:Եթե ​​կա ուժեղացում, նշանակում է՝ կա աղտոտվածություն։

Ստանդարտներ
Ստանդարտները հայտնի կոնցենտրացիայի կամ պատճենների թվի նմուշներ են, որոնք օգտագործվում են ստանդարտ կորի կառուցման համար:Ստանդարտի կայունությունն ապահովելու համար գենի բեկորը սովորաբար կլոնավորվում է պլազմիդի մեջ և օգտագործվում որպես ստանդարտ։

Ստանդարտ կորը
սովորաբար նոսրացվում է առնվազն 5 կոնցենտրացիայի գրադիենտների մեջ ստանդարտ արտադրանքի հետ՝ ըստ կրկնապատկման հարաբերակցության, և 5 միավոր գծվում է CT արժեքի և պատճենի համարի կոորդինատներում, և կետերը միացվում են գիծ ձևավորելու համար՝ ստանդարտ կոր ստեղծելու համար:Յուրաքանչյուր ստանդարտ կորի համար անհրաժեշտ է ստուգել դրա վավերականությունը:Լանջի արժեքը ընկնում է –3.3-ից –3.8-ի սահմաններում, և յուրաքանչյուր կոնցենտրացիան կատարվում է եռակի:Այն կետերը, որոնք զգալիորեն տարբերվում են այլ կետերից, պետք է անտեսվեն:Փորձարկվող նմուշի CT արժեքը բերվում է ստանդարտ կորի մեջ և կարող է հաշվարկվել փորձարկվող նմուշի արտահայտման մակարդակը:

Փորձարկվող նմուշի CT արժեքը բերվում է ստանդարտ կորի մեջ և կարող է հաշվարկվել փորձարկվող նմուշի սկզբնական պատճենի թիվը:

Արդյունավետություն և թեքություն
Ստանդարտ կորի թեքությունը ներկայացնում է իրական ժամանակի PCR-ի արդյունավետությունը:
· -3,322 թեքություն ցույց է տալիս, որ PCR ուժեղացման արդյունավետությունը 1 կամ 100% արդյունավետ է, և PCR արտադրանքի քանակը կրկնապատկվում է յուրաքանչյուր ցիկլում:
·–3,322-ից պակաս թեքություն (օրինակ՝ –3,8) ցույց է տալիս PCR արդյունավետությունը
·–3.322-ից մեծ թեքություն (օրինակ՝ –3.0) ցույց է տալիս, որ PCR արդյունավետությունը, ըստ երևույթին, ավելի մեծ է, քան 100%, ինչը հետաքրքիր է, թե ինչպե՞ս կարող է PCR-ի մեկ ցիկլը կրկնապատկել ուժեղացված արտադրանքը:Այս իրավիճակը տեղի է ունենում PCR ռեակցիայի ոչ գծային փուլում, այսինքն, մեծ քանակությամբ ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում կա:

հալման կորը
qPCR ուժեղացման ավարտից հետո PCR արտադրանքը տաքացվում է:Ջերմաստիճանի բարձրացման հետ մեկտեղ երկշղթա ուժեղացման արտադրանքը աստիճանաբար հալչում է, ինչի հետևանքով նվազում է լյումինեսցենցիայի ինտենսիվությունը:Երբ որոշակի ջերմաստիճան (Tm) հասնում է, մեծ քանակությամբ ապրանքներ կհալվեն:Լյումինեսցենտությունը կտրուկ նվազում է:Տարբեր PCR արտադրանքներ ունեն տարբեր Tm արժեքներ և տարբեր հալման ջերմաստիճաններ, այնպես որ PCR-ի առանձնահատկությունը հնարավոր է նույնացնել:

Հալման կոր (ածանցյալ կոր)
Հալման կորը ստացվում է գագաթնակետային քարտեզ ձևավորելու համար, որը կարող է ավելի ինտուիտիվ կերպով ցուցադրել PCR արտադրանքի բեկորների իրավիճակը:Քանի որ հալման ջերմաստիճանը ԴՆԹ-ի հատվածի Tm արժեքն է, որոշ պարամետրեր, որոնք ազդում են ԴՆԹ-ի հատվածի Tm արժեքի վրա, կարելի է դատել, ինչպիսիք են բեկորի չափը, GC-ի պարունակությունը և այլն: Ընդհանուր առմամբ, ըստ մեր այբբենարանի ձևավորման սկզբունքների,ուժեղացված արտադրանքի երկարությունը 80-300bp-ի սահմաններում է, ուստի հալման ջերմաստիճանը պետք է լինի 80°C-ից մինչև 90°C:

Հալման կորի մեկնաբանությունԵթե ​​միակ հիմնական գագաթնակետը հայտնվում է 80°C-90°C միջակայքում, դա նշանակում է, որ լյումինեսցենտային քանակական PCR-ն կատարյալ է.եթե հիմնական գագաթնակետը հայտնվում է 80°C-90°C-ի սահմաններում, իսկ տարբեր գագաթները հայտնվում են 80°C-ից ցածր, ապա հիմնականում դիտարկվում է այբբենարանի դիմերը:Այն լուծելու համար կարող եք փորձել բարձրացնել եռացման ջերմաստիճանը.եթե հիմնական գագաթնակետը հայտնվում է 80°C-90°C-ի սահմաններում, իսկ տարբեր գագաթնակետը կրկին հայտնվում է, երբ ջերմաստիճանը բարձրանում է, ապա հիմնականում համարվում է, որ առկա է ԴՆԹ-ի աղտոտվածություն, և ԴՆԹ-ն պետք է հեռացվի փորձի սկզբնական փուլում:

Իհարկե, դեռ կան որոշ աննորմալ իրավիճակներ, որոնք ստորև հերթով կպարզվեն։
3. Ընդլայնված գիտելիքներ

qPCR անելու համար ես պետք է ասեմ MIQE,Նվազագույն տեղեկատվություն-ի հրապարակման համարՔանակականԻրական ժամանակի PCRՓորձեր՝ նվազագույն տեղեկատվություն իրական ժամանակի քանակական PCR-ի մասին հոդվածներ հրապարակելու համարփորձեր.Բոլորի ըմբռնումը պարզեցնելու համար մենք կպարզեցնենք հիմնական բովանդակությունը։

MIQE-ի օրիգինալ տեքստը կարող եք որոնել ինտերնետում, և ամենակարևորն այն է, որ այն սահմանում է.տվյալների ստուգաթերթ, որը պետք է տրամադրվի հոդված հրապարակելիս .

Գրախոսները կարող են դատել փորձի որակը՝ կարդալով այս մանրամասները.ապագա ընթերցողները կարող են նաև օգտագործել սա փորձը կրկնելու կամ բարելավելու համար:
Հարկ է նշել, որ այս ցանկում յուրաքանչյուր ցուցակի կարևորությունը նշված է համապատասխանաբար E կամ D-ով:Ինչ է դա նշանակում?E. էական տեղեկատվություն (պետք է ներկայացվի);Դ՝ ցանկալի տեղեկատվություն (տրամադրել որքան հնարավոր է շատ):

MIQE (1) — Փորձարարական դիզայն
Շատ տականքներ, ովքեր ավարտել են իրենց պաշտպանությունը ասպիրանտուրայի ավարտից հետո, չեն իմանա, թե ինչպես ինքնուրույն նախագծել փորձ, բացել իրենց տետրերը և անել այն, ինչ ուսուցիչը նրանց ասում է:Արդյունքում, փորձարարական ձևավորումը խիստ չէր, և ամսագրի խմբագրությունն ասաց, որ իրենք ցանկանում էին այս նկարն ու այն նկարը հորինել, ուստի դա արեցին շվարած։Ահա թե ինչպես են ստեղծված տականքները։

Տանն ավելի մոտ, փորձի առաջին սկզբունքը որոշելն էփորձարարական տրամաբանության խստությունը.Ամենակարևորը փորձարարական ձևավորումն է, և ամենակարևորը փորձարարական նախագծման մեջ այն է, թե ինչպես պետք է սահմանել թիրախային նմուշը, հղման նմուշը (վերահսկողությունը) և կրկնությունների քանակը, որպեսզի փորձարարական տվյալները լինեն հղում, համեմատելի և համոզիչ:

Թիրախային նմուշըվերաբերում է նմուշին, որը պահանջում է մեզանից հայտնաբերել թիրախային գենը որոշակի բուժումից հետո:Հղման նմուշըայն նմուշն է՝ առանց որևէ բուժման, որը կենսաբանության մեջ հաճախ անվանում են վայրի տեսակ։

Փորձարարական կրկնօրինակներշատ կարևոր են.Ընդհանուր առմամբ, համոզիչ կրկնօրինակների թիվը պետք է լինի երեքից ավելի:Պետք է տարբերակել, թե ինչ է կենսաբանական վերարտադրությունը, ինչը՝ տեխնիկական։

Կենսաբանական կրկնօրինակներՆույն ստուգման փորձը կատարվել է տարբեր նյութերով (ժամանակ, բույսեր, խմբաքանակներ, ռեակցիայի թիթեղներ):

Կենսաբանական կրկնօրինակում
Որպես օրինակ վերցնենք պղպեղի թունաքիմիկատների բուժումը։Մենք ուզում ենք թունաքիմիկատներ ցողել ABC-ի երեք բույսերի վրա, այնուհետև ABC-ի երեք բույսերը երեք կենսաբանական կրկնօրինակներ են, և դրանք նույն ստուգման փորձն են, որն իրականացվել է տարբեր նյութերով:Բայց որպես փորձ, հսկողություն անպայման պետք է, ուստի կարող ենք A բույսի ճյուղերից մեկը ցողել A բույսի փորձնական խումբ կազմելու համար, իսկ A բույսի մյուս ճյուղերը չսրսկել՝ վերահսկիչ խումբ կազմելու համար:Նույնը արեք B-ի և C-ի համար:

Տեխնիկական կրկնօրինակներ (Տեխնիկական կրկնօրինակներ)Սա կրկնվող փորձ է, որը նախատեսված է շահագործման հետևանքով առաջացած սխալներից խուսափելու համար, որը իրականում նույն նյութի մեջ ներառված կրկնօրինակ անցք է:Ե՛վ բուժման, և՛ վերահսկման միջոցները պետք է ունենան թիրախային գենի և ներքին հղման գենի կրկնվող պարամետրեր (առնվազն երեք):

Տեխնիկական կրկնություն
Կրկին օրինակ վերցրեք թունաքիմիկատներով մշակված պղպեղը։Ա բույսի փորձարարական խմբի համար մենք պատրաստեցինք երեք PCR անցք՝ 1, 2 և 3՝ համապատասխանաբար նրա թիրախային գենի և ներքին հղումային գենի համար, որպեսզի հայտնաբերումից հետո միջինը վերցնենք:Ա գործարանի վերահսկման համար Խմբերը նույնպես վերաբերվում են նույն կերպ:Նմանապես, կատարեք նույն բուժումը B և C բույսերի համար:Սա տեխնիկական կրկնություն է։

Հարկ է նշել, որայն, ինչ մտնում է վիճակագրության մեջ, կենսաբանական կրկնությունն է, իսկ տեխնիկական կրկնությունը փորձարկում է, թե արդյոք պատահական երևույթներ կան փորձարարական գործընթացում, որպեսզի փորձարարական արդյունքներն արժանահավատ լինեն, այսինքն՝ սխալներից խուսափելու համար՝ վերցնելով դրանց միջինը, ինչպես մենք հաճախ ենք ասում:

Բացասական հսկողություն - NTC և NRT
NTC (առանց կաղապարի հսկողություն), հսկիչ առանց կաղապարի, օգտագործվում է ստուգելու, թե արդյոք փորձնական նյութը աղտոտված է:Ընդհանրապես, ջուրն օգտագործվում է որպես կաղապար։Եթե ​​կա լյումինեսցենտային ռեակցիա, դա ցույց է տալիս, որ լաբորատորիայում տեղի է ունեցել նուկլեինաթթուների աղտոտում:

Այս աղտոտումները առաջանում են՝ անմաքուր ջրից, էնդոգեն ԴՆԹ պարունակող ոչ որակավորված ռեակտիվներից, այբբենարանային աղտոտվածությունից, լաբորատոր սարքավորումների աղտոտումից, աերոզոլային աղտոտվածությունից և այլն, անհրաժեշտ է օգտագործել RNase մաքրող միջոցներ և RNase ինհիբիտորներ:Աերոզոլային աղտոտվածությունը ամենադժվարն է հայտնաբերել:Պատկերացրեք, որ ձեր լաբորատորիան նման է մշուշի, օդում կախված տարբեր նուկլեինաթթուներով:

NRT (առանց հակադարձ տրանսկրիպտազի), վերահսկողությունն առանց հակադարձ տրանսկրիպցիայի, ոչ հակադարձ տրանսկրիպացված ՌՆԹ-ն է՝ որպես բացասական վերահսկողություն, որը հանդիսանում է gDNA մնացորդի հսկողություն։

Գենի էքսպրեսիա անելիս ՌՆԹ-ի քանակը հայտնաբերվում է հակադարձ տրանսկրիպցիայից հետո cDNA-ի քանակի հայտնաբերմամբ:Եթե ​​ՌՆԹ-ի մաքրման ժամանակ կա gDNA մնացորդ, դա կառաջացնի սխալներ փորձարարական արդյունքներում, քանի որ ստացված փաստացի արդյունքները gDNA և cDNA են:Համախառն մակարդակում, ոչ միայն cDNA, gDNA-ն պետք է ամբողջությամբ հեռացվի ՌՆԹ-ի արդյունահանման ժամանակ:

MIQE (2) — նմուշային տեղեկատվություն
Այսպես կոչված ընտրանքային տեղեկատվություն նշանակում է, որ երբ մենք հրապարակում ենք qPCR-ի մասին հոդված, մենք պետք է հստակ բացատրենք նմուշի տեղեկատվությունը, որը հոդվածի անփոխարինելի մասն է:Նմանապես, երբ մենք մշակում ենք նմուշները, մենք պետք է նաև կարգավորենք մեր սեփական գործողությունները՝ ապահովելու համար նմուշների վավերականությունը:

Նմուշի նկարագրությունը միայն արդյունք է, և ամբողջ փորձի ընթացքում վերցված նյութերին պետք է ավելի շատ ուշադրություն դարձնել։

Փորձարարական նյութերի ընտրություն
Արյան նմուշներ – ընտրեք թարմ արյուն, ոչ ավելի, քան 4 ժամ:Բջջային նմուշներ – ընտրեք թարմ բջիջներ հավաքել ակտիվ աճի ժամանակաշրջանում:Կենդանական հյուսվածք - Ընտրեք թարմ, ակտիվ աճող հյուսվածք:Բուսական հյուսվածք – Ընտրեք թարմ, երիտասարդ հյուսվածք:

Դուք, հավանաբար, նկատել եք, որ այս մի քանի նախադասության մեջ մի բանալի բառ կա՝ թարմ:
Վերոնշյալ նմուշների համար շուկայում լավագույն, ծախսարդյունավետ և կայուն փաթեթը Foregene-ի հավաքածուն է, որը կարող է արագ և հեշտությամբ արդյունահանել դրանց ԴՆԹ-ն և ՌՆԹ-ն:

Արյան ԴՆԹ-ի մինի հավաքածու

Բջջի ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու

Կենդանիների ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու

Բույսերի ընդհանուր ՌՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Բույսերի ԴՆԹ-ի մեկուսացման հավաքածու

Փորձարարական նյութերի պահպանում
Ընդհանուր առմամբ, մենք խորհուրդ չենք տալիս նմուշներ պահել, եթե պայմանները թույլ են տալիս:Այնուամենայնիվ, կան շատ ընկերներ, ովքեր չեն կարող փորձարկումներ կատարել անմիջապես նմուշառումից հետո, և ոմանք նույնիսկ կարիք ունեն հեղուկ ազոտի տանկերի դաշտ տանել նմուշառման համար:

Այս կարգի աշխատասեր ընկերոջ համար կարող եմ միայն ասել, որ դուք չեք հասկանում ռեագենտների սպառման նյութերը:Այժմ ռեակտիվների սպառման շատ ընկերություններ արտադրում են ռեակտիվներ, որոնք կարող են պահել ՌՆԹ-ի նմուշները սենյակային ջերմաստիճանում, և դուք կարող եք ընտրել դրանք օգտագործել:Պահպանման պայմանական մեթոդը հեղուկ ազոտի պահեստավորումն է՝ օգտագործելով հեղուկ ազոտի փոքր բաք, որը հեշտ է տեղափոխել:Նմուշը լաբորատորիա բերելուց հետո այն պահել -80°C սառնարանում:

ՌՆԹ-ի հետ կապված փորձերի համար պետք է հետևել վեց բառի սկզբունքին.ցածր ջերմաստիճան, առանց ֆերմենտների,ևարագ .

Ցածր ջերմաստիճանի հասկացությունը հեշտ է հասկանալ.առանց ֆերմենտների, RNase-ն ամենուր է աշխարհում, որտեղ մենք ապրում ենք (հակառակ դեպքում դուք կսպանեիք ՄԻԱՎ-ով), այնպես որ, թե ինչպես խուսափել RNase-ից փորձեր կատարելիս շատ կարևոր հասկացություն է.արագ,Աշխարհում չկա Կունգ Ֆու, որը չի կարելի կոտրել, միայն արագությունը չի կարող կոտրվել.

Հետևաբար, ինչ-որ իմաստով, որքան կարճ է արդյունահանման ժամանակը, այնքան լավ է հավաքածուն:ԻնչուForegene-ի հանդերձանքն ընդգծում է արագությունը, քանի որ նրանք դա լավ գիտեն:

Հ.Գ. Որոշ աղջիկներ շատ զգույշ են փորձարկումներ անում, բայց մի քանի տարվա աշխատանքից հետո դրանք այնքան էլ լավը չեն, որքան սլեմ դանքը:Նրանք զգում են, որ Աստված անարդար է, դժգոհում է ուրիշներից և կյանք է փնտրում։Իրականում նա դա չհասկացավ։Նա լավ չէր պաշտպանում ՌՆԹ-ն, իսկ սլեմ-դանկի խաղացողը ճարպիկ էր:Երբ նա անում էր փորձը, կարծում էր, որ սլեմ դանքը կավարտի երեք անգամ, հինգ անգամ և երկու բաժանումներով, բայց փորձը լավ արեց։

ՆշումԱվելի դանդաղ, RNase-ի ներխուժման ավելի շատ հնարավորություններ:Ինչպե՞ս վարժեցնել ձեզ արագ լինելու համար:Ճանապարհ չկա, պարզապես ավելի շատ պարապեք:

Տարբեր փորձերի և տարբեր նմուշների համար դեռևս անհրաժեշտ է ավելի շատ գրականություն կարդալ և մշակման համապատասխան մեթոդ ընտրել։Նմուշների հավաքման և պահպանման գործընթացի համար MIQE-ն պահանջում է, որ այն պետք է հստակ գրվի թղթի մեջ, որպեսզի գրախոսները կարողանան ստուգել թղթի հուսալիությունը, ինչպես նաև հարմար է ապշած երիտասարդների համար կրկնել ձեր փորձը:

Թեև կենսաբանական փորձերը դժվար են, դրանք բարձր մակարդակի են:Եթե ​​ուշադիր չլինես, կարող ես աշխարհը շրջել։Օրինակ՝ SARS-ը վերածել կենսաքիմիական ճգնաժամի կամ հիբրիդային բրինձ պատրաստել՝ 1,3 միլիարդ մարդու փրկելու համար:Ստորև բերված նկարը քիմիական փորձ է, դուք պետք է հասկանաք, թե որքան եք հպարտանում ձեր հետազոտությամբ՝ միայն նայելով նրա դիակի տեսքին:Մոռացեք, մի սևացրեք նրան:

MIQE (3) - նուկլեինաթթվի արդյունահանում:
Նուկլեինաթթվի արդյունահանումը մեծ իրադարձություն է, և մոլեկուլային կենսաբանության բոլոր փորձերը սկսվում են նուկլեինաթթվի արդյունահանմամբ:Նախ, եկեք պատճենենք MIQE-ի բովանդակությունը նուկլեինաթթվի արդյունահանման վերաբերյալ:

Նայելով այս ձևին, դուք չեք կարող մնալ մակերեսի վրա:Ձևը դոգմա է:Լավագույն ուսանող լինելու համար պետք է հարցնել, թե ինչու:Այս աղյուսակի հիմնական բովանդակությունն է. ՀետապնդելՌՆԹ-ի մաքրությունը, ամբողջականությունը, հետևողականությունը և արդյունահանման քանակը .

-ի առաջին մասըգործընթացը կամ գործիքը նուկլեինաթթվի արդյունահանման քայլն է:Եթե ​​արդյունահանման համար օգտագործում եք նուկլեինաթթվի ավտոմատ արդյունահանող (ընդլայնված, գնման համար խնդրում ենք կապվել ինձ հետ), պետք է նշեք գործիքի մոդելի անվանումը:

Կոմպլեկտի անվանումը և

թե ինչ փաթեթ է օգտագործվել փոփոխության մանրամասների համար, ինչ հատուկ ռեակտիվներ են ավելացվել կամ ինչ հատուկ գործողություններ են կատարվել, պետք է հստակ բացատրվի, որպեսզի մյուսները հեշտությամբ կրկնեն ձեր փորձը:

Ոմանք հատուկ նմուշներ հանելիս ավելացնում են հատուկ ռեակտիվներ՝ մտածելով, որ դա իրենց գաղտնի զենքն է և ուրիշներին չեն ասում։Գաղտնի պահելով հանդերձ, նրանք կորցնում են նաև ձեր հոդվածը փայլեցնելու հնարավորությունը։Խելոք մի եղիր, գիտական ​​հետազոտություններում պետք է ավելի ազնիվ լինես, քան երկրի ծեր Ժանգը, եթե ուզում ես խելացի լինել, հոդվածը քեզ հիմար կդարձնի։

պետք է հիշել փաթեթի արտադրանքի համարըերբ պատվիրում եք հավաքածուն և գրում հոդվածը:Հավաքածուի վրա, ընդհանուր առմամբ, կա երկու համար՝ Cat՝ կատալոգի համարը (ապրանքի համարը, հոդվածի համարը), Լոտը՝ ապրանքի խմբաքանակի համարը ( Օգտագործվում է ցույց տալու համար, թե որ խմբաքանակից է ապրանքը եկել):

Բացի այդ, CAS համարը հաճախ օգտագործվում է կենսաքիմիական ռեակտիվներ պատվիրելիս, և ես այն միասին կհայտնեմ:CAS համարն այն թիվն է, որը տրվում է Ամերիկյան քիմիական ընկերության կողմից յուրաքանչյուր նոր քիմիական դեղամիջոցին:Ընդհանուր առմամբ, երեք թվեր միացված են գծիկով:Ռուշուի CAS համարը՝ 7732-18-5:Քիմիական նյութերը հաճախ ունենում են բազմաթիվ անուններ, սակայն CAS համարը եզակի է:Դեղ պատվիրելիս նախ կարող եք ստուգել դրա CAS համարը:

Տանն ավելի մոտ, ինչու՞ մենք պետք է հստակ նկարագրենք այս բաները:Փաստորեն, դա նաև ՌՆԹ արդյունահանման որակը ստուգելու համար է:Գործիքների և փաթեթների օգտագործումը ՌՆԹ-ի արդյունահանումը կդարձնի ավելի հետևողական:Սովորական լաբորատորիաների արդյունահանման սանդղակը մեծ չէ, և այն կարելի է ձեռք բերել փաթեթներով։

DNase կամ RNase բուժման մանրամասները
Լյումինեսցենտային քանակական PCR-ի կարևոր խնդիրը ԴՆԹ-ի աղտոտումը կանխելն է, և եթե կա աղտոտվածություն, մի փորձեք:Հետևաբար, հրամայական է նշել այն գործընթացը, որը դուք օգտագործել եք ԴՆԹ-ի մշակման համար, որպեսզի ապացուցեք, որ փորձարարական գործընթացում ԴՆԹ-ն ամբողջությամբ և ամբողջությամբ հեռացվել է:ներկայացված է սխեմատիկ դիագրամով:

ՌՆԹ-ի և ԴՆԹ-ի սխեմատիկ դիագրամ
Ընդհանուր առմամբ, ԴՆԹ-ի հեռացման մեթոդը արդյունահանումից հետո ՌՆԹ-ն DNase-ով մշակելն է:Այնուամենայնիվ, դրանք համեմատաբար հին մեթոդներ են:Առևտրային ՌՆԹ-ի արդյունահանման փաթեթները կարողացել են հեռացնել ԴՆԹ-ն արդյունահանման գործընթացում` առանց DNase ավելացնելու:Օրինակ, մի շարք փաթեթներ Foregene-ից:

ՆշումՌՆԹ-ի արդյունահանման ժամանակ ԴՆԹ-ի հեռացումը շատ վտանգավոր երկսայրի սուր է, որը կերկարացնի ՌՆԹ-ի արդյունահանման գործողության ժամանակը և կբարձրացնի ՌՆԹ-ի քայքայման վտանգը:Հիմնականում դա փոխզիջում է ՌՆԹ-ի ստացման և մաքրության միջև:

Բացի այդ, սիլիցիումի վրա հիմնված կլանման սյունակում ավելացված DNase-ի քանակը շատ փոքր է, և էֆեկտի հասնելու համար պետք է օգտագործվի բարձրորակ DNase:Չօպտիմիզացված DNase-ը չի կարող արագ և ամբողջությամբ մարսվել:Սա վաճառականի տեխնիկական մակարդակի թեստ է։Իհարկե, կան նույնիսկ ավելի տարօրինակ առևտրականներ, ովքեր պարծենում են, որ ԴՆԹ-ն կարելի է հեռացնել առանց DNase-ի:Կարելի է ասել, որ նա, ով պարծենում է, որ ԴՆԹ-ն կարելի է ամբողջությամբ հեռացնել առանց DNase-ի, խուլիգան է։ԴՆԹ-ն համեմատաբար կայուն երկշղթա կառուցվածք է, և այն հնարավոր չէ վերացնել միայն խոսելով և ծիծաղելով:

Աղտոտվածության գնահատում
գնահատման մեթոդ՝ էլեկտրոֆորեզի հայտնաբերում, 1% ագարոզա, 6V/cm, 15min, բեռնում 1-3 ul

Նուկլեինաթթվի քանակական վերլուծություն
սովորաբար չափվում է ուլտրամանուշակագույն սպեկտրոֆոտոմետրի միջոցով:Թույլ տվեք նախ հանրահռչակել OD260, OD280 և OD230 երեք արժեքների իմաստը:
·OD260nm. Դա նուկլեինաթթվի ամենաբարձր կլանման գագաթնակետի կլանման ալիքի երկարությունն է, և լավագույն չափված արժեքը տատանվում է 0,1-ից մինչև 1,0:Եթե ​​ոչ, ապա նոսրացրեք կամ խտացրեք նմուշը, որպեսզի այն հասցվի տիրույթի սահմաններում:
·OD280nm. Սա սպիտակուցների և ֆենոլային նյութերի կլանման ամենաբարձր գագաթնակետի ալիքի երկարությունն է:
·OD230nm. Դա ածխաջրերի ամենաբարձր կլանման գագաթնակետի կլանման ալիքի երկարությունն է:

Հաջորդը, եկեք խոսենք յուրաքանչյուր ցուցանիշի դերի մասին:A260-ի համար այն կարող է օգտագործվել նուկլեինաթթվի ելքը չափելու համար:Երբ OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml:

Մաքրության համար մենք պետք է նայենք այն հարաբերակցություններին, որոնք սովորաբար տեսնում ենք՝ OD260/280 և OD260/230:
Մաքուր ԴՆԹ. OD260/280 մոտավորապես հավասար է 1.8-ի:Երբ այն մեծ է 1,9-ից, դա ցույց է տալիս, որ կա ՌՆԹ-ի աղտոտվածություն, իսկ երբ այն փոքր է 1,6-ից, նշանակում է, որ կա սպիտակուցներով և ֆենոլով աղտոտվածություն:
· Մաքուր ՌՆԹ՝ 1.7
·OD260/230. Անկախ նրանից, թե դա ԴՆԹ է, թե ՌՆԹ, հղման արժեքը 2.5 է:Երբ այն 2.0-ից պակաս է, դա ցույց է տալիս, որ կա շաքարի, աղի և օրգանական նյութերի աղտոտվածություն:

ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը

Շատ կարևոր է չափել ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը:Ընդհանրապես, անհրաժեշտ է կատարել ՌՆԹ-ի դենատուրացիայի գել փորձ՝ ստուգելու համար, թե արդյոք 28S և 18S ՌՆԹ-ի միջև պայծառությունը երկակի հարաբերություն է:Երբ հայտնվում է 5S երրորդ գոտին, նշանակում է, որ ՌՆԹ-ն սկսել է քայքայվել, բացառությամբ անողնաշարավորների։

Տվյալներ ՌՆԹ-ի որակի գնահատման համար. Բացի վերը նշված թեստերից, կան նաև ավելի առաջադեմ գործիքային թեստեր ՌՆԹ-ի ամբողջականության առումով, ինչպես օրինակ Experion ավտոմատ էլեկտրաֆորեզի համակարգի RQI ամբողջականության թեստը, որը կարող է հայտնաբերել, թե արդյոք ՌՆԹ-ն անտեսանելիորեն քայքայված է:

Գիտական ​​հետազոտություններում լյումինեսցենտային քանակական PCR-ն թիրախ գենի և ներքին հղումային գենի համեմատությունն է:Հետևաբար, ՌՆԹ-ի նմուշների պահպանման, ՌՆԹ-ի արդյունահանման և այլնի գործընթացում առաջնային նպատակն է ապահովել ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը:

Ինչպես է ՌՆԹ-ի ամբողջականությունն ազդում թիրախ գենի և ներքին հղման գենի հավասարակշռության վրա, կարելի է հեշտությամբ հասկանալ ստորև նկարից:Դեգրադացիան կբերի գենի ոչ լրիվության, լինի դա ներքին ռեֆերենս գենի թերի լինելը, թե թիրախային գենի ոչ լրիվությունը, դա մեծ ազդեցություն կունենա տվյալների վրա։

Թիրախային գենի և տեղեկատու գենի սխեմատիկ դիագրամը չպետք է ճիշտ լինի

Արգելակման թեստ (արդյոք CT արժեքը ճնշված է բարձր կամ ցածր կոնցենտրացիայի կամ այլ պայմաններում)

Այս ցուցանիշը որպես օրինակ վերցնելով՝ հինգ կորերի Ct արժեքները հետևյալն են.CT արժեքների բաշխումը կորերի միջև անհավասար է, և Ct արժեքները հետաձգվում են բարձր և ցածր կոնցենտրացիաների դեպքում, ինչը PCR արգելակման դեպքում է:

Հիմնական կետ. ՌՆԹ արդյունահանման գործընթացում մենք պետք է հրաժարվենք սխալ պատկերացումներից և հաստատենք ճիշտը:

Սխալ գաղափարն այն է, որ ՌՆԹ-ի արդյունահանումը միայն հետևում է բերքատվությանը՝ մտածելով, որ որքան մեծ է ստացված ՌՆԹ-ի քանակը, այնքան լավ:Իրականում, երբ մենք քանակականացում ենք անում, եթե գեների թիվը շատ մեծ չէ, մեզ շատ ՌՆԹ-ի կարիք չի զգացվում:Ձեր արդյունահանվող ՌՆԹ-ի քանակն ավելի քան բավարար է:

Ճիշտ հայեցակարգը հետևյալն է.ՌՆԹ արդյունահանումը պետք է հետապնդի մաքրությունը, ամբողջականությունը և հետևողականությունը.Մաքրությունը կարող է ապահովել, որ հետագա հակադարձ տրանսկրիպցիան չի արգելակվի, և տվյալները չեն ազդի ԴՆԹ-ի վրա:Ամբողջականությունը ապահովում է թիրախային հաջորդականությունների և ներքին հղումների հավասարակշռությունը:Հետևողականությունը ապահովում է նմուշի կայուն բեռնում:

MIQE (4) – հակադարձ արտագրում
Սխալ կարծիքՆմուշի ավելի մեծ ծավալի ձգտումը:
Ճիշտ հայեցակարգՀետևեք հետևողականությանը (կայունությանը), անկախ բեռնված ՌՆԹ-ի քանակից, հակադարձ տառադարձման արդյունավետությունը մնում է հետևողական՝ ապահովելով, որ cDNA-ի տարբերությունները կարող են իսկապես արտացոլել mRNA-ի տարբերությունները:
Մենք բացատրում ենք այս գործընթացը սխեմատիկ դիագրամով.

Հակադարձ արտագրման արդյունավետության սխեմատիկ դիագրամ, ճիշտ չէ
Առաջին հերթին մենք պետք է հասկանանք հակադարձ տրանսկրիպցիայի գործընթացի և PCR գործընթացի տարբերությունը:ՊՇՌ-ն ենթարկվում է բազմաթիվ տաքացման և եռացման գործընթացների, և թիրախային բեկորը աճում է էքսպոնենցիալ;մինչդեռ հակառակ տրանսկրիպցիան չունի այս գործընթացը, մենք կարող ենք պատկերացնել, որ հակադարձ տառադարձումն իրականում մեկ առ մեկ է կրկնօրինակման գործընթացում ՌՆԹ-ի նույնքան կտոր

քանի որ կան կարող են ստանալ նույնքան կտոր cDNA տեղեկատվությունը, այն պետք է հասկանալի լինի մինչ այժմ, քանի որ մեծ ու փոքր բեկորները հակադարձ արտագրվել են, և անհնար է կենտրոնանալ մեկ հատվածի վրա:Եվ քանի որ ՌՆԹ-ի քանակը համեմատաբար փոքր է, ստացված cDNA-ի քանակը նույնպես համեմատաբար փոքր է, ի տարբերություն PCR-ի, որն ունի ուժեղացման ազդեցություն, ուստի այն հիմնականում անհնար է հայտնաբերել:

cDNA էլեկտրոֆորեզի արդյունքները
Երկրորդ, իդեալական դեպքում, հակադարձ տրանսկրիպցիան կատարվում է մեկ առ մեկ, բայց ոչ մի ընկերության հակադարձ տրանսկրիպտազ չի կարող հասնել այս էֆեկտին:Հիմնականում հակադարձ տրանսկրիպտազների մեծ մասի արդյունավետությունը տատանվում է 30-50%-ի սահմաններում:Եթե ​​դա այդպես է, մենք նախընտրում ենք ունենալ համեմատաբար կայուն հակադարձ տառադարձման արդյունավետություն, ինչը մենք ուզում ենք տեսնել նկարում. 3 ՌՆԹ-ն ստանում է 2 cDNA, 6 ՌՆԹ-ն ստանում է 4 cDNA, այնպես որ, անկախ նրանից, թե որքան նմուշ է բեռնված, հակադարձ տառադարձման արդյունավետությունը համեմատաբար կայուն է:Մենք չենք ցանկանում տեսնել այն իրավիճակը, երբ հակադարձ արտագրման արդյունավետությունը անկայուն է, և բարձր կոնցենտրացիան արգելակվում է:

Այսպիսով, ինչպե՞ս ստուգել, ​​թե արդյոք հակադարձ արտագրման արդյունավետությունը կայուն է:Մեթոդը շատ պարզ է, պետք է միայն համեմատական ​​թեստ անել. մեկը՝ հակադարձ արտագրել cDNA-ի ՌՆԹ-ի կրկնապատկվելուց հետո, իսկ մյուսը՝ կրկնապատկել նոսրացումը՝ հակադարձ արտագրվելուց հետո cDNA-ի մեջ, այնուհետև անել qPCR՝ ստացված թեքությունը տեսնելու համար Արդյո՞ք դա համահունչ է:Որպես բարձրակարգ ուսանող, դուք պետք է դա հասկանաք վայրկյանների ընթացքում:Ինչպես ցույց է տրված ստորև.

ՌՆԹ-ի և cDNA-ի նոսրացում՝ ստուգելու համար, թե արդյոք հակադարձ տրանսկրիպցիայի արդյունավետությունը կայուն է
Հակադարձ տրանսկրիպտազ և հավաքածու
Ինչպես կարող է կատարյալ լյումինեսցենտային քանակական PCR ունենալ գերազանց հակադարձ տրանսկրիպտազ և հավաքածու:Հակադարձ տրանսկրիպտազը մոտավորապես բաժանվում է երկու տեսակի՝ ըստ աղբյուրի՝ AMV կամM-MLV, և դրանց կատարումը նույնն է, ինչ ցույց է տրված աղյուսակում։

RNase H ակտիվություն
RNase H-ը Ribonuclease H-ն է, չինական անունը՝ ribonuclease H, որը էնդորիբոնուկլեազ է, որը կարող է հատուկ հիդրոլիզացնել ՌՆԹ-ն ԴՆԹ-ՌՆԹ հիբրիդային շղթայում:RNase H-ը չի կարող հիդրոլիզացնել ֆոսֆոդիստերային կապերը միաշղթա կամ երկշղթա ԴՆԹ-ում կամ ՌՆԹ-ում, այսինքն՝ չի կարող մարսել միաշղթա կամ երկշղթա ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն։Սովորաբար օգտագործվում է cDNA-ի երկրորդ շղթայի սինթեզում:

Տարօրինակ բան է։Մենք ասում ենք, որ հակադարձ տրանսկրիպտազն ունի RNase H ակտիվություն, այլ ոչ թե հակադարձ տրանսկրիպտազը պարունակում է RNase H, և հնարավոր չէ, որ RNase H-ն առանձնացնել հակադարձ տրանսկրիպտազից, հավանաբար այն պատճառով, որ հակադարձ տրանսկրիպտազում որոշակի խմբերի ձևավորում է:

Հետևաբար, անկախ AMV-ի հակադարձ արտագրման ավելի բարձր արդյունավետությունից, նրա RNase H ակտիվությունը նվազեցնում է cDNA-ի ելքը:Իհարկե, ռեակտիվ արտադրողները մշտապես օպտիմիզացնում են իրենց արտադրանքը, որպեսզի հնարավորինս վերացնեն RNase H-ի ակտիվությունը հակադարձ տրանսկրիպտազում՝ cDNA-ի ելքը մեծացնելու համար:
Հալման ջերմաստիճանը

ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը տարբեր ջերմաստիճաններում
Տե՛ս վերևի նկարը տարբեր ջերմաստիճաններում ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքի համար և օգտագործի՛ր mFold առցանց գործիքը՝ որոշակի ջերմաստիճանի և աղի կոնցենտրացիայի պայմաններում թիրախային հատվածի երկրորդական կառուցվածքը որոշելու համար:55°C-ում ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը դեռ շատ բարդ է, հակադարձ տրանսկրիպտազը չի կարող աշխատել, և երկրորդական կառուցվածքը չի կարող ամբողջությամբ լուծվել մինչև 65°C, մինչդեռ AMV-ի և M-MLV-ի օպտիմալ ջերմաստիճանը շատ ավելի ցածր է այս ջերմաստիճանից:
ինչ անել?Երկրորդական կառուցվածքը ինքնին ձևանմուշի լրացուցիչ զուգավորումն է, որը հանգեցնում է այբբենարանի և հակադարձ տրանսկրիպտազի և կաղապարի միջև ուժեղ մրցակցության, ինչը հանգեցնում է մի շարք խնդիրների, ինչպիսիք են ցածր E-ն և վատ կրկնելիությունը:

ինչ անել?Միայն եռացման ջերմաստիճանը հնարավորինս բարձրացրեք:

Ռեակտիվների շատ արտադրողներ բարելավում են իրենց հակադարձ տրանսկրիպտազը գենետիկ ինժեներիայի միջոցով:Ոմանք բարձրացնում են ռեակցիայի ջերմաստիճանը, օրինակ՝ Ջիֆանը և Աիդելայը, իսկ ոմանք հեռացնում են RNase H ֆերմենտի ակտիվ խումբը՝ ֆերմենտի և ՌՆԹ կաղապարի միջև կապը բարելավելու համար։Բարձր հարաբերակցությունը կարող է մրցակցային կերպով սեղմել երկրորդական կառուցվածքը և սահուն կարդալ, ինչպես նաև զգալիորեն բարելավել հակադարձ տառադարձման արդյունավետությունը:
Հիմնական կետ. Հակադարձ արտագրումն ավելի կարևոր է հակադարձ տառադարձման արդյունավետության հետևողականությունը պահպանելու համար (ֆերմենտները պետք է ոչ միայն արդյունավետ լինեն, այլև կայուն), քան բեռնված նմուշի քանակությունը, եթե դա առանձնապես լայնածավալ լյումինեսցենտ քանակական PCR չէ, դա ընդհանրապես հնարավոր չի լինի:Բազմաթիվ cDNA-ներ:
Տարբեր արտադրողներ նույնպես որոշակի ջանքեր են գործադրել հետևողականության համար:Օրինակ, ընկերությունների մեծամասնությունն այժմ փաթեթավորել է հակադարձ արտագրումը որպես վաճառքի ստանդարտ փաթեթ, ինչը լավ ընտրություն է:
Օրինակ, Foregene-ի RT Easy Series հավաքածուները.

RT Easy I (Գլխավոր պրեմիքս առաջին շղթայի cDNA սինթեզի հավաքածուի համար)

MIQE (5) - թիրախային գենի տեղեկատվություն

Վերոնշյալ նկարը բացատրում է
1. Արդյոք այս գենը արդյունավետ է կրկնվող փորձերի համար, ընդհանուր առմամբ, կարելի է ստուգել կրկնվող փորձերի միջոցով:
2. Գենի ID, դուք գիտեք:
3. Գենի երկարությունը, թիրախ գենի ընդհանուր երկարությունը հաստատ խնդիր չէ:Պրայմերներ նախագծելիս համոզվեք, որ ամպլիկոնի երկարությունը 80-200 բ/վ է, ուժեղացման ավելի լավ արդյունավետություն ապահովելու համար:
4. Sequence Blast-ի համեմատական ​​տեղեկատվություն, նպատակային գենը պետք է համեմատվի գենբանկում՝ ոչ սպեցիֆիկ ամպլիֆիկացիան կանխելու համար:
5. Պսեւդոգենների առկայությունը.Կեղծոգենը ԴՆԹ-ի հաջորդականություն է, որը նման է նորմալ գենին, բայց կորցնում է իր բնականոն գործառույթը:Այն հաճախ հանդիպում է էուկարիոտների բազմագենի ընտանիքում։Այն սովորաբար ներկայացված է ψ.Դա գենոմի ոչ ֆունկցիոնալ գենոմային ԴՆԹ-ի պատճեն է, որը շատ նման է կոդավորող գեների հաջորդականությանը:, հիմնականում չեն արտագրվում և չունեն հստակ ֆիզիոլոգիական նշանակություն:
6. Պրայմերների դիրքը էկզոնների և ինտրոնների նկատմամբ:Առաջին տարիներին, երբ մենք լուծում էինք ԴՆԹ-ի աղտոտվածության խնդիրը, մենք հաճախ ուշադրություն էինք դարձնում պրայմերների, էկզոնների և ինտրոնների դիրքերին և, ընդհանուր առմամբ, մտածում էինք ինտրոնների միջով այբբենարանների նախագծման մասին՝ ԴՆԹ-ի ուժեղացումից խուսափելու համար:Խնդրում ենք տեսնել ստորև նկարը. սևը ներկայացնում է ինտրոններ, զանազան կապույտները ներկայացնում են էկզոններ, վարդագույնը ներկայացնում է սովորական այբբենարաններ, իսկ վառ կարմիրը ներկայացնում է ինտրոնային այբբենարաններ:

Սխեմատիկ, երբեք ճիշտ
Սա ինչ կատարյալ ծրագիր է թվում, բայց իրականում, շատ դեպքերում, տրանս-ինտրոնային այբբենարաններն այնքան էլ կախարդական չեն, որքան պատկերացնում ենք, և դրանք նաև կառաջացնեն ոչ հատուկ ուժեղացում:Այսպիսով, ԴՆԹ-ի աղտոտումը կանխելու լավագույն միջոցը ԴՆԹ-ի ամբողջական հեռացումն է:
7. Կոնֆորմացիայի կանխատեսում.Կրկին օգտագործելով այս օրինակը, օգտագործեք mFold առցանց գործիքը՝ որոշակի ջերմաստիճանի և աղի կոնցենտրացիայի դեպքում թիրախային հատվածի երկրորդական կառուցվածքը որոշելու համար:

ՌՆԹ-ի երկրորդական կառուցվածքը տարբեր ջերմաստիճաններում
Երկրորդական կառուցվածքը ինքնին ձևանմուշի լրացուցիչ զուգավորումն է, որը կհանգեցնի ուժեղ մրցակցության այբբենարանի և ձևանմուշի զուգակցման միջև, և այբբենարանի կապման հնարավորություններն ավելի քիչ են, ինչը հանգեցնում է մի շարք խնդիրների, ինչպիսիք են ցածր E-ն և վատ կրկնելիությունը:Ծրագրային կանխատեսման միջոցով, եթե չկա երկրորդական կառուցվածքի խնդիր, դա հիանալի կլինի:Եթե ​​կա, մեր հաջորդ հոդվածը հատուկ կքննարկի, թե ինչպես լուծել այս խնդիրը:

MIQE (6) - qPCR օլիգոնուկլեոտիդներ

Լյումինեսցենտային քանակական PCR-ի համար առաջին բանը, որի հետ դուք ամեն օր պայքարում եք, ՌՆԹ-ի արդյունահանումն է, և երկրորդը կարող է լինել այբբենարանի ձևավորումը:
Նախ, մենք դեռ ստուգում ենք այբբենարանի ձևավորման կանոնները՝ համաձայն MIQE ստուգաթերթի:Այն այնքան պարզ է, որ տականքները կարող են ծիծաղել, և մենք կարող ենք այն ավարտել մեկ նախադասությամբ՝ պարզել այբբենարանի զոնդի հաջորդականությունն ու դիրքը և փոփոխության մեթոդը:Պրայմերների մաքրման մեթոդի համար այբբենարանի սինթեզը ներկայումս այնքան էժան է, qPCR-ն արժանի է PAGE և ավելի բարձր մաքրման մեթոդներին, և սինթեզի գործիքի մասին տեղեկատվությունը կարևոր չէ:Շատերը տասնամյակներ շարունակ պրայմերներ են անում և չգիտեն, որ սինթեզատորը ABI3900 է:
Ինչ վերաբերում է այբբենարանի ձևավորման սկզբունքներին, ապա պետք չէ դրանք անգիր անել, քանի որ այբբենարանի նախագծման ծրագրերի կամ առցանց գործիքների մեծ մասը կարող է լուծել այս խնդիրները (խորհուրդ է տրվում առցանց գործիք primer3.ut.ee/), իսկ այբբենարանի ձևավորման 99,999%-ը ձեռքով չի արվում։
Պարզապես ստուգեք հետևյալ կետերը այբբենարանների նախագծումից հետո.
1. Դիզայնի պրայմերներ մոտ 3' ծայրին. cDNA-ի առաջին շղթայի սինթեզի համար օլիգո dT պրայմերների օգտագործման դեպքում, հաշվի առնելով հակադարձ տառադարձման արդյունավետությունը և ՌՆԹ-ի ամբողջականությունը, նախագծված պրայմերները պետք է նախագծվեն 3' ծայրին մոտ՝ ուժեղացման արդյունավետությունը բարելավելու համար:Օգտագործեք նկարը հետևյալ կերպ բացատրելու համար (սա հասկանալու միջոց չկա).

Ինչու՞ պետք է այբբենարանները նախագծված լինեն 3' ծայրին մոտ, դա չպետք է ճիշտ լինի
2. TM արժեք. Tm արժեքը 55-65°C է (քանի որ էկզոնուկլեազի ակտիվությունն ամենաբարձրն է 60°C-ում), իսկ GC-ի պարունակությունը 40%-60% է:
3. BLAST. Գենոմի ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումից խուսափելու համար Blast-ը պետք է օգտագործվի լրացուցիչ ստուգման համար:

MIQE (7) - qPCR գործընթաց

1. qPCR հավաքածու
Համաձայն MIQE-ի պահանջների՝ հոդվածում մենք պետք է հստակ նկարագրենք ռեակցիայի ամբողջական պայմանները, ներառյալ PCR ռեակցիայի համակարգի կազմաձևումը, ինչ փաթեթ է օգտագործվում, ով է արտադրողը, որքան մեծ է ռեակցիայի համակարգը, օգտագործված է ներկման մեթոդը, թե զոնդի մեթոդը, PCR ծրագրի կարգավորումները:Վետերան վարորդները անպայման կգտնեն, որ քանի դեռ հավաքածուն ընտրված է, վերը նշված տեղեկատվությունը հիմնականում որոշված ​​է:
Ներկայումս լյումինեսցենտային քանակական PCR փաթեթների արտադրությունն ու արտադրությունը շատ հասուն տեխնոլոգիա է:Քանի դեռ դուք չեք ընտրել ծայրահեղ վատ արտադրողներ, խնդիրների հավանականությունը մեծ չէ, բայց մենք դեռ ուզում ենք ձեզ հետ կիսվել մի քանի կետով.
Hot-start Taq enzyme:PCR-ի ամենակարևոր մասը տաք մեկնարկող Taq ֆերմենտն է:Շուկայում առկա տաք մեկնարկի ֆերմենտները սովորաբար բաժանվում են երկու տեսակի, մեկը քիմիապես ձևափոխված տաք մեկնարկային ֆերմենտ է (կարող եք պատկերացնել այն որպես պարաֆինի ներկառուցում), իսկ մյուսը` Հակամարմինների փոփոխման տաք մեկնարկային ֆերմենտ է (հակագին-հակամարմին կապող):Քիմիական մոդիֆիկացիան տաք մեկնարկող ֆերմենտների վաղ ձևն է:Երբ հասնում է որոշակի ջերմաստիճան, ֆերմենտը կթողնի իր ակտիվությունը:Հակամարմինների կողմից ձևափոխված տաք մեկնարկային ֆերմենտը օգտագործում է կենսաբանական մեթոդներ՝ արգելափակելու ֆերմենտի ակտիվությունը:Որոշակի ջերմաստիճանի հասնելու դեպքում հակամարմինը կվերածվի և կակտիվանա որպես սպիտակուց, և ֆերմենտային ակտիվությունը կգործարկվի:

Այնուամենայնիվ, ո՞րն է սրանից օգուտ:Սա այն դեպքն է, որ հակամարմիններով ձևափոխված ֆերմենտների արտազատման ակտիվությունն ավելի արագ է, քան քիմիապես ձևափոխված ֆերմենտներինը, ուստի զգայունության առումով հակամարմիններով ձևափոխված ֆերմենտները մի փոքր առավելություն ունեն, այնպես որ, ըստ էության, շուկայում քիմիապես ձևափոխված ֆերմենտներ չկան:Եթե ​​կա, ապա այս արտադրողի տեխնոլոգիան դեռ խրված է հազարամյակի դարաշրջանում:
Մագնեզիումի իոնի կոնցենտրացիան.ՊՇՌ ռեակցիայում մագնեզիումի իոնի կոնցենտրացիան շատ կարևոր է:Մագնեզիումի իոնների համապատասխան կոնցենտրացիան կարող է նպաստել Taq ֆերմենտի ակտիվության ազատմանը:Եթե ​​կոնցենտրացիան չափազանց ցածր է, ֆերմենտի ակտիվությունը զգալիորեն կնվազի.եթե կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, ֆերմենտի կատալիզացված ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումը կուժեղանա:Մագնեզիումի իոնների կոնցենտրացիան նույնպես կազդի պրայմերների եռացման, կաղապարի հալման ջերմաստիճանի և ՊՇՌ արտադրանքների վրա՝ դրանով իսկ ազդելով ուժեղացված բեկորների բերքատվության վրա:Մագնեզիումի իոնների կոնցենտրացիան սովորաբար վերահսկվում է 25 մՄ-ում:Իհարկե, լավ հավաքածուի համար մագնեզիումի իոնների կոնցենտրացիան պետք է լավ վերահսկվի:Որոշ առևտրականներ ռեագենտին ավելացնում են մագնեզիումի իոնային քելացնող նյութ, որը կարող է հասնել մագնեզիումի իոնի կոնցենտրացիայի ավտոմատ ճշգրտման էֆեկտի:
Լյումինեսցենտային ներկերի կոնցենտրացիան.Լյումինեսցենտ ներկ, որն այն է, որը մենք սովորաբար օգտագործում ենք Sybr Green- ը, հիմնականում առաջացնում է լյումինեսիա, կապելով երկկողմանի ԴՆԹ-ի աննշան ակոսին, քանի որ դրա հետ կապված է, որպեսզի դրա հետ համատեղ լինի, որպեսզի դրա հետ համատեղ լինի:
Հ.Գ. Իր լուսազգայուն հատկությունների շնորհիվ շուկայում ապրանքները սովորաբար փաթեթավորված են շագանակագույն անթափանց ցենտրիֆուգային խողովակներում (ինչպես ցույց է տրված ստորև նկարում):Այնուամենայնիվ, սա կբախվի խնդրի.Դժվար է տեսնել, թե արդյոք հեղուկը ներծծվում է նմուշառման ժամանակ:Այս առումով, Qingke-ն իսկապես օգտագործողի համար առավել հարմար է (ինչպես ցույց է տրված ստորև նկարում), և թափանցիկ խողովակը փաթեթավորված է անթափանց թիթեղյա տոպրակի մեջ:Այնուհետև դրեք այն թիթեղյա տոպրակի մեջ՝ հաշվի առնելով լույսից և նմուշառումից խուսափելու հարմարավետությունը:Դուք պետք է ընտրեք ճիշտ ապրանքի համարը:TSE204-ը սուպեր ծախսարդյունավետ գոյություն է, որն ինձ ստիպում է խոտ տնկել:

Շատ կարևոր է նաև լյումինեսցենտային ներկի կոնցենտրացիան։Եթե ​​կոնցենտրացիան չափազանց ցածր է, ապա ուժեղացման կորը չի բարձրանա հետագա փուլում և կատարյալ չէ.եթե կոնցենտրացիան չափազանց բարձր է, դա կառաջացնի աղմուկի միջամտություն:Քանի որ լյումինեսցենտային քանակական ՊՇՌ-ն հիմնականում կախված է CT արժեքից, եթե լյումինեսցենտային ներկի կոնցենտրացիան ճիշտ չի կարգավորվում, ցածր կետն ավելի լավ է, քան բարձր կետը:Իհարկե, ներկի համապատասխան կոնցենտրացիան լավագույնն է:

ROXROX ներկերը օգտագործվում են լավ-լավ ֆլուորեսցենտային ազդանշանի սխալները շտկելու համար:Գործիքների որոշ արտադրողներ պահանջում են տրամաչափում, իսկ մյուսները՝ ոչ:Օրինակ, Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR ուժեղացման գործիքի օգտագործումը սովորաբար պահանջում է չափաբերում, ներառյալ 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus և այլն: Ընդհանուր հավաքածուի հրահանգները նկարագրում են այն:
Foregene-ի qPCR Mix-ը պարունակում է նաև ROX ներկ, որը հարմար է տարբեր մոդելներում օգտագործելու համար։

Իրական ժամանակում PCR Kit-Taqman

Թույլ ջրածնային կապի բուժումԹույլ ջրածնային կապերի բուժումը համեմատաբար տեխնիկական խնդիր է:Ոչինչ չի կարդացել բազմաթիվ փաթեթների ձեռնարկները, բայց նրանցից ոչ մեկը չի նշել այս թեման:Իրականում դա այնքան կարևոր է։Հիմքերի համակցությունը հիմնականում կախված է ջրածնային կապերի ամրությունից։Ուժեղ ջրածնային կապերը նորմալ ուժեղացում են, իսկ թույլ ջրածնային կապերը հանգեցնում են ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման:Եթե ​​թույլ ջրածնային կապերը հնարավոր չէ լավ վերացնել, ապա ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացումից հնարավոր չէ խուսափել:Հեղինակի շրջանակներում միայն մի քանի ընկերություններ են նկատել այս խնդիրը:Կոմպլեկտը գնելիս կարող եք անդրադառնալ, թե արդյոք այս առումով լուծում եք դիտարկել այն հանդերձանքի համար, որը ցանկանում եք ընտրել:

Ռեակցիայի ծավալը20-50ուլ համակարգն ավելի հաճախ օգտագործվում է, և ավելի փոքր ծավալները կարող են սխալներ առաջացնել:Ընդհանուր առմամբ, փաթեթի հրահանգները խորհուրդ կտան օգտագործել PCR ռեակցիայի ծավալները:Խելացի մի եղեք և ծախսերը խնայելու համար օգտագործեք ավելի փոքր ծավալներ:-ի նպատակը։Առևտրականների առաջարկած ծավալն իրականում փորձարկվել է, և հնարավոր է, որ նրանք չեն կարող լուծել փոքր ծավալների պատճառով առաջացած սխալների խնդիրը։
2. Խողովակի ափսեի արտադրողը և հոդվածի համարը
Բոլորը գիտեն լյումինեսցենտային քանակական PCR-ի սկզբունքը:Ֆլյուորեսցենտային հավաքումը հիմնականում իրականացվում է PCR խողովակի կափարիչների միջոցով:PCR ծախսվող նյութեր ընտրելիս ուշադրություն դարձրեք երկու կետի՝ լավ լույսի փոխանցման և գործիքի համար հարմար:Ընդհանուր առմամբ, հիմնական ապրանքանիշերի տախտակները և խողովակները լավ են, բայց դուք պետք է ուշադիր ընտրեք հարմարվողականության առումով, հակառակ դեպքում չեք կարողանա օգտագործել գործիքը:

4. Բարձր մակարդակի գիտելիքներ

MIQE (8) - qPCR վավերացում
Սա qPCR-ի գլխավոր առաջնահերթությունն է:Այստեղ այնքան հերոսներ են ընկել ավազի մեջ։Իհարկե, հնարավոր է նաև, որ ձեր բախտը բերել է, և ձեր ուսումնասիրած գեները պարզ են, այնպես որ դուք լողում եք սառցե քարանձավով քամու երկայնքով:qPCR-ի ստուգման տեղեկատվությունը նախատեսված է տվյալների հավաստիությունը ստուգելու համար:Մենք թվարկում ենք ստուգման անհրաժեշտ տեղեկատվությունը հետևյալ կերպ.

1. Հատուկության թեստ
Թիրախային գենի ամպլիֆիկացիայի առանձնահատկությունը ստուգվում է՝ ստուգելով, թե արդյոք էլեկտրոֆորեզի պատկերը մեկ ժապավեն է.հաջորդականության ստուգում;հալման կորը՝ տեսնելու, թե արդյոք գագաթնակետային քարտեզը միայնակ է.ֆերմենտների մարսողության ստուգում և այլ մեթոդներ:
Այստեղ մենք կենտրոնանում ենք տոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման վերլուծություն՝ հալման կորերի մեթոդով.Ընդհանուր առմամբ, երբ մենք նախագծում ենք պրայմերներ, արտադրանքի հատվածի չափը պետք է լինի 80-200 bp միջակայքում, ինչը կազմում է PCR արտադրանքի հալման ջերմաստիճանը 80-85 °C միջակայքում:Հետևաբար, եթե կան տարբեր գագաթներ, պետք է լինեն այլ ոչ հատուկ ուժեղացման արտադրանք.եթե գագաթնակետը հայտնվում է 80°C-ից ցածր, այն սովորաբար համարվում է այբբենարանի դիմեր;եթե գագաթնակետը հայտնվում է 85°C-ից բարձր, ապա դա սովորաբար համարվում է ԴՆԹ-ի աղտոտվածություն կամ մեծ բեկորների ավելի ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում:
Նշում. Երբեմն 80°C ջերմաստիճանում միայն մեկ գագաթ կա:Այս պահին այս հայեցակարգը պետք է պահպանվի:Հավանական է, որ ուժեղացման արդյունքները բոլորը այբբենարանային դիմերներ են:

Նորմալ հալման կոր (մեկ գագաթ առանց ոչ հատուկ ուժեղացման)

Հալման խնդրահարույց կոր (կեղծ գագաթների ոչ հատուկ ուժեղացում)
【Դեպքի վերլուծություն】

Կա հիմնական գագաթ, բայց այբբենարանի դիմերը լուրջ է
Ստորև բերված նկարում պատկերված մեկ գագաթնակետային հալման կորը հեշտությամբ կարող է խաբել ձեր աչքերը՝ կարծելով, որ դա կատարյալ փորձ է, բայց արդյունքը լիովին սխալ է:Այս պահին մենք պետք է նայենք հալման ջերմաստիճանին:Պիկ ջերմաստիճանը 80°C-ից ցածր է, որն ամբողջությամբ այբբենարան-դիմեր է:

Թիրախային բեկոր չկա, բոլոր այբբենարանային դիմերները
Այստեղ եղբայրս չի կարող կանգ առնել։Ստորև ներկայացված նկարը բջջային հեռախոսով նկարված լուսանկար է, որն ինձ ուղարկել է մի տականք։Նրա օգտագործած ռեակտիվները բոլորն էլ արդյունաբերության մեջ սովորաբար օգտագործվող ապրանքանիշեր են:Նա մի T-prefix ապրանքանիշից փոխվեց մեկ այլ T-prefix ապրանքանիշի:Կարծում եմ՝ արդեն գուշակել եք։«Առաջին նկարում օգտագործված ռեագենտը շատ լավն է, իսկ պիկը միայնակ է»:Հետագայում ձեր առաջարկած ռեագենտն օգտագործելուց հետո այն դառնում է երկրորդ նկարի նման՝ խառը գագաթներով։Դու ինձ դժբախտացրել ես։«
Առանձնացրեք երկու գրաֆիկները:Առաջին հայացքից մեկն ունի մեկ գագաթ, իսկ մյուսը՝ կրկնակի գագաթ։Անհեթեթություն, մեկ գագաթն իհարկե լավ է:Դա ճի՞շտ է։
Dou E-ից վատ, եթե ստորև նկարում երկու նկարը դնեմ, անմիջապես կհասկանաք։Փաստորեն, մենք հեշտությամբ կաթվածահար ենք լինում այս տեսակի պատկերից։Մանրակրկիտ վերլուծությունից հետո մենք պարզեցինք, որ.երկրորդ ցուցանիշի գագաթնակետը հայտնվում է 75°C և 82°C ջերմաստիճանում, առնվազն կան Արտադրանքը հայտնվում է:

Ուսանողների արձագանքների նկարներ
Այսպիսով, հիմնարար խնդիրը ոչ թե ռեակտիվների խնդիրն է, այլ այբբենարանի ձևավորման խնդիրը:Միևնույն ժամանակ, դա նաև ապացուցում է, որ որոշ խոշոր ապրանքանիշեր երկաթի որակի չեն, և դա նաև ապացուցում է այն, ինչ նախկինում ասաց եղբայրս.Դա ձեր հոդվածն է, որը պաշտպանել է ռեագենտների ապրանքանիշը:Պարզապես պատկերացրեք, եթե տականքը չփոխեր ռեագենտները, սխալ տվյալներ կուղարկվեին ամսագրին, և ինչ կլիներ, ողբերգություն կլիներ:
2. Դատարկ հսկողության Ct արժեքը
Մի բացատրեք, եթե դատարկ կոնտրոլը Ct արժեք ունի, դա աղտոտվածություն չէ՞։Այնուամենայնիվ, դուք դեռ պետք է հասկանաք, թե որ դատարկ հսկողությունն ունի Ct արժեք:Եթե ​​դա NTC է, նշանակում է, որ կա օտար ԴՆԹ, ինչպիսին է ռեագենտով աղտոտվածությունը:Եթե ​​դա NRT է, նշանակում է, որ արդյունահանված ՌՆԹ-ն ունի ԴՆԹ-ի աղտոտվածություն։
3. Ստանդարտ կոր
Ներառելով թեքության և հաշվարկի բանաձևը, PCR արդյունավետությունը կարող է հաշվարկվել բանաձևի միջոցով:Կատարյալ փորձի համար պահանջվում է, որ ստանդարտ կորի թեքությունը մոտենա 3,32-ին, իսկ R²-ին մոտենա 0,9999-ին:
4. Գծային դինամիկ տիրույթ
Ռեակցիայի դինամիկ տիրույթը գծային է։Ըստ ստանդարտ կորի ստեղծման համար օգտագործվող ձևանմուշի, դինամիկ միջակայքը պետք է ներառի առնվազն 5 կոնցենտրացիայի գրադիենտ և ուշադրություն դարձնի Ct արժեքների փոփոխությանը բարձր կոնցենտրացիայի գրադիենտներում և ցածր կոնցենտրացիայի գրադիենտներում:
5. Հայտնաբերման ճշգրտություն
qPCR արդյունքների փոփոխությունները, այսինքն՝ վատ կրկնելիությունը, այսինքն՝ թույլ ճշգրտությունը, պայմանավորված են բազմաթիվ գործոններով, ներառյալ ջերմաստիճանը, կոնցենտրացիան և աշխատանքը:qPCR ճշգրտությունը սովորաբար դառնում է ավելի քիչ վերահսկելի, քանի որ պատճենների թիվը նվազում է:Իդեալական դեպքում փորձարարական տատանումների մեջ այս տեխնիկական փոփոխությունը պետք է տարբերվի կենսաբանական տատանումներից, և կենսաբանական կրկնօրինակները կարող են ուղղակիորեն անդրադառնալ qPCR արդյունքների վիճակագրական տարբերություններին խմբերի կամ բուժման միջև:Հատկապես ախտորոշիչ անալիզների համար պետք է զեկուցվի լավագույն միջվերլուծական ճշգրտությունը (կրկնելիությունը) տարբեր վայրերում և օպերատորներում:
6. Հայտնաբերման արդյունավետություն և LOD (մուլտիպլեքս qPCR-ում)
LOD-ը հայտնաբերված դրական նմուշների 95%-ի ամենացածր կոնցենտրացիան է:Այլ կերպ ասած, LOD-ի կոնցենտրացիան, որը պարունակվում է թիրախ գեների կրկնօրինակների հավաքածուում, չպետք է գերազանցի ձախողված ռեակցիաների 5%-ը:Մուլտիպլեքս qPCR վերլուծություն կատարելիս, հատկապես կետային մուտացիաների կամ պոլիմորֆիզմների միաժամանակյա հայտնաբերման համար, մուլտիպլեքսային qPCR-ն պետք է ապացույցներ ներկայացնի, որ միևնույն խողովակում բազմաթիվ թիրախային բեկորների ճշգրտությունը չի վտանգված, բազմակի հայտնաբերումը և մեկ խողովակի հայտնաբերումը Արդյունավետությունը և LOD-ը պետք է նույնը լինեն:Հատկապես, երբ բարձր կոնցենտրացիայի թիրախային գեները և ցածր կոնցենտրացիայի թիրախային գեները միաժամանակ ուժեղացվում են, այս խնդրին պետք է ուշադրություն դարձնել:
Խնդիրներ և լուծումներԸնդհանուր առմամբ, qPCR վրիպազերծման ժամանակ հաճախ հանդիպող խնդիրները կենտրոնանում են հետևյալ ասպեկտների վրա.
· ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում
· Պրայմերների կոնցենտրացիայի դժվար ընտրություն և պրայմեր-դիմերների հետ կապված խնդիրներ
· Հալման ջերմաստիճանը ճշգրիտ չէ
·Երկրորդային կառուցվածքը ազդում է ուժեղացման արդյունավետության վրա
ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացում
ոչ հատուկ ուժեղացումտեղի է ունենում, ընդհանուր առմամբ համարվում է, թե արդյոք այբբենարանի դիզայնը հարմար չէ, բայց եթե չեք շտապում փոխել այբբենարանները, կարող եք նախ փորձել հետևյալ մեթոդները (սկզբունքը նույնպես կցվում է).
· Բարձրացնել եռացման ջերմաստիճանը. փորձեք թույլ ջրածնային կապեր ստեղծել, որոնք չեն կարող պահպանել;
· Կրճատել եռացման և երկարացման ժամանակը – նվազեցնել ջրածնային թույլ կապերի հավանականությունը;
· Կրճատել այբբենարանի կոնցենտրացիան – նվազեցնել ավելորդ այբբենարանների և ոչ թիրախային շրջանների միացման հնարավորությունը;
Ուժեղացման ցածր արդյունավետություն
Ոչ սպեցիֆիկ ուժեղացման հակառակ իրավիճակը՝ ուժեղացման ցածր արդյունավետություն, և ուժեղացման ցածր արդյունավետության հետ կապված միջոցառումները ճիշտ հակառակն են.
· Երկարացնել կռման և երկարացման ժամանակը;
· Փոխել եռաստիճան PCR-ի և նվազեցնել եռացման ջերմաստիճանը;
· Բարձրացնել այբբենարանի կոնցենտրացիան;
Ps90-ականներին ծնված շատ ասպիրանտներ չեն ցանկանում ուսումնասիրել, թե ինչպես կարելի է վրիպազերծել փորձերը, և հուսով են, որ փաթեթը կարող է ամբողջությամբ լուծել խնդիրը (եթե ուզում եք գնալ ռեագենտների ընկերություն՝ ավարտելուց հետո հետազոտություններ և մշակումներ անելու համար), իրականում ռեագենտ արտադրողները նույնպես այդպես են մտածում, հուսով եմ, որ դա հիմարություն է։ թույլ H- կապի կլանման գործոններ.Խնդիրը հեշտությամբ լուծելու համար հիմարները դեռևս պետք է կարդան ռեագենտների ընկերության ներածությունը՝ տեսնելու, թե արդյոք կա որևէ գործոն, որը կլանում է թույլ ջրածնային կապերը:
Պրայմերների կոնցենտրացիայի դժվար ընտրություն և պրայմեր-դիմերների հետ կապված խնդիրներ
Մեթոդ 1Ընդհանուր առմամբ, qPCR-ի համար նախատեսված հավաքածուի հրահանգներն ունեն առաջարկվող համակարգեր և առաջարկվող պրիմերի կոնցենտրացիաներ:
Մեթոդ 2Վրիպազերծում` սահմանելով այբբենարանի կոնցենտրացիայի գրադիենտը:Ստորև նկարը գողացված է ընկերությունից՝ ցույց տալու համար:Ստորև բերված նկարը ցույց է տալիս ֆլուորեսցենտային քանակական արդյունքները, որոնք արվել են երեք այբբենարանի կոնցենտրացիայի գրադիենտներով (100nM, 250nM, 500nM) և չորս կաղապարի կոնցենտրացիայի գրադիենտներով (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng):Փորձարարական արդյունքների Ct արժեքը գծագրվում է հետևյալ կերպ.

Նախաներկի կոնցենտրացիայի ընտրությունը Միացրեք յուրաքանչյուր այբբենարանի կոնցենտրացիան գծի մեջ հետևյալ կերպ.

Ակնհայտ է այբբենարանի կոնցենտրացիայի ընտրությունը, 100nM և 250nM այբբենարանի կոնցենտրացիայի գծային կապն ավելի լավ է, իսկ 500nM այբբենարանի կոնցենտրացիայի գծային կապը համեմատաբար վատ է:100nM-ում և 250nM-ում 250nM-ի Ct-ի արժեքը համեմատաբար փոքր է, ուստի այբբենարանի օպտիմալ կոնցենտրացիան 250nM է:Ընդհանուր առմամբ ծանր այբբենարան-դիմերներ կարելի է տեսնել հալման կորի մեջ:Իսկ եթե նախագծված այբբենարանները չկարողանան խուսափել այբբենարան-դիմերներից:
Մեթոդ 3Նվազեցրեք պրայմերների քանակը և բարձրացրեք եռացման ջերմաստիճանը (բացատրելու կարիք չկա):
Եռման ջերմաստիճանի էմպիրիկ արժեքը 60°C է։Եթե ​​վստահ չեք, ինչպե՞ս ընտրել եռացման ավելի հարմար ջերմաստիճան:Պատասխանը նույնն է, ինչ այբբենարանի կոնցենտրացիայի ընտրությունը.գրադիենտ թեստ.Լուսանկարեք Bio-rad ընկերությունից՝ խնդիրը լուսաբանելու համար:Որոշակի թիրախային հատվածի ուժեղացման համար սահմանեք ութ ջերմաստիճանի գրադիենտ, յուրաքանչյուրը երեք կրկնությամբ, և ստացված ուժեղացման կորը հետևյալն է.

եռացման ջերմաստիճանի ընտրություն.
·70°C, 69°C — Հիմնականում այբբենարանները չեն կարող համակցվել, ուստի ուժեղացում չկա:
·67.3°C – Սկզբում կա մի փոքր ուժեղացում, իսկ Ct-ի արժեքը համեմատաբար մեծ է:
·64,5°C—— Ct-ի արժեքը նվազում է:
·60.7°C, 58.0°C, 56.2°C և 55.0°C ջերմաստիճանում Ct-ի արժեքները հիմնականում կայուն էին, բայց ֆլյուորեսցենցիայի վերջնական արժեքները տարբեր էին:
Ինչպե՞ս ընտրել:Սկզբունք. Առաջին սկզբունքը Ct-ի ավելի բարձր արժեքն է:Նույն Ct արժեքի համար ընտրեք եռացման ավելի բարձր ջերմաստիճան՝ դիմերացումից և ոչ հատուկ ուժեղացումից խուսափելու համար:Թեև 55°C-ում ավելի բարձր ֆլյուորեսցենտային արժեք կա, դրա մեջ կարող են լինել դիմերներ կամ ոչ հատուկ ուժեղացում:
Բայց եթե դու նույնքան խելացի ես, ինչպես դու, անպայման կմտածես. Տրամաբանորեն ասած, եթե PCR ռեակցիան շատ կոնկրետ է, քանի դեռ պրայմերների կոնցենտրացիան գերազանցում է նվազագույն պահանջը, բարձր և ցածր կետերը չպետք է ազդեցություն ունենան, ինչպես լյումինեսցենտային ներկերն ու dNTP-ները:Իրոք, քանի դեռ եռացման ջերմաստիճանը պատշաճ կերպով օպտիմիզացված է, այբբենարանի կոնցենտրացիայի ազդեցությունը Ct արժեքի վրա բնականաբար նվազագույնի կհասցվի:

Եռացման ջերմաստիճանը պատշաճ կերպով օպտիմիզացված է, և այբբենարանի կոնցենտրացիայի ազդեցությունը CT-ի վրա նվազագույնի կհասցվի
Երկրորդական կառուցվածքը ազդում է ուժեղացման արդյունավետության վրա
Վերցնենք նկարը Bio-rad-ից՝ խնդիրը լուսաբանելու համար:Այն նաև նախագծում է ջերմաստիճանի գրադիենտ՝ երկրորդական կառուցվածք ունեցող գենը ուժեղացնելու համար:

Առաջանում է երկրորդական կառուցվածք
Կարելի է տեսնել, որ երբ ջերմաստիճանի գրադիենտը նվազում է, արտադրանքները սկսում են հայտնվել, և Ct արժեքը առաջ է շարժվում՝ հասնելով նվազագույն արժեքին 60,7°C-ում, իսկ հետո, երբ ջերմաստիճանի գրադիենտը նվազում է, Ct արժեքը դառնում է ավելի մեծ։Ընդհակառակը, երբ ջերմաստիճանը բարձրանում է, երկրորդական կառուցվածքը բացվում է, և ուժեղացման արդյունավետությունը մեծանում է:Որոշակի ջերմաստիճանի հասնելուց հետո ջերմաստիճանի բարձրացումը չի կարող բարելավել ուժեղացման արդյունավետությունը:Քանի որ այս պահին այբբենարանները չեն կարող կայունորեն համակցվել:Հետեւաբար,փնտրեք ջերմաստիճանը ամենացածր Ct արժեքով, որը լավագույն ջերմաստիճանն է երկրորդական կառուցվածքի կաղապարը ուժեղացնելու համար:Իհարկե, խելացի հիմարները պետք է իմանան, որ եթե դա անհրաժեշտ չէ, ապա ավելի լավ է փոխել այբբենարանները և խուսափել երկրորդական կառուցվածքի շրջանից:
5. Կիրառման մակարդակ
MIQE - տվյալների վերլուծություն

Տվյալների վերլուծությունը հիմնականում տրվում է լյումինեսցենտային քանակական PCR գործիքով:Նախորդ հոդվածում կատարվել են տվյալների վերլուծության բազմաթիվ աշխատանքներ, օրինակ՝ դատարկ հսկողությունը, որը բացատրվել է փորձի նախագծման մեջ։Հստակեցվել են ներքին հղման գեները, կրկնվող թվերը և այլն։, այստեղ հիմնականում բացատրում ենք qPCR-ի կիրառումը։
qPCR-ն լայնորեն կիրառվում է, իսկ փորձարարական ստուգումը և նուկլեինաթթվի ախտորոշումը ամենից հաճախ օգտագործվող սցենարներն են:
բացարձակ քանակականացում
Մատյան (նախնական կոնցենտրացիան) գծային կապ ունի ցիկլերի քանակի հետ։Ստանդարտ կորը կարելի է գծել ստանդարտից, որի սկզբնական պատճենի համարը հայտնի է, այսինքն՝ կարելի է ստանալ ուժեղացման ռեակցիայի գծային կապը:Ըստ նմուշի Ct արժեքի, նմուշի կոնցենտրացիան կարող է հաշվարկվել:Ներառվող կաղապարների քանակը:

Բացարձակ քանակական հաշվարկի մեթոդ
Բացարձակ քանակական հաշվարկը պետք է հիմնված լինի ստանդարտ կորի վրա:Ստանդարտ կորի պատրաստման համար պահանջվում է ստանդարտ:Սովորաբար ստանդարտը պլազմիդ է, որը ստացվում է թիրախային գենի կլոնավորմամբ:Ինչու է դա պլազմիդ:Քանի որ շրջանաձև պլազմիդային ԴՆԹ-ն ամենակայունն է:Ստանդարտ արտադրանքը նոսրացրեք 5-ից 6 գրադիենտներով՝ ըստ կրկնապատկման հարաբերակցության (10 անգամ նոսրացում) և նոսրացնելիս ուշադրություն դարձրեք միատեսակությանը:Թող Ct արժեքը ընկնի 15-30-ի միջև:

Ստանդարտ պատրաստում
Միևնույն ժամանակ, փորձարկվող նմուշը նույնպես պետք է համապատասխանաբար նոսրացվի (հիշեք նոսրացման գործակիցը), և Ct-ի արժեքը նույնպես պետք է ընկնի 15-30-ի միջև:Ստանդարտ արտադրանքը + փորձարկվող նմուշը միասին դրվում են մեքենայի վրա:Գործարկումից հետո ստանդարտ նյութով կազմվեց ստանդարտ կոր, և փորձարկվող նմուշները բերվեցին ստանդարտ կորի մեջ՝ կոնցենտրացիան հաշվարկելու համար:
Հեպատիտ B վիրուսի HBV քանակականացումը տիպիկ բացարձակ քանակություն է, որը կարող է հաշվարկել վիրուսի պատճենի թիվը 1 մլ արյան մեջ:
Պատճենների համարի հաշվարկ
Փորձարկվող նմուշի կոնցենտրացիան (նգ/ուլ) = OD260 × 50 մգ/մլ × նոսրացման գործակից
Նմուշի մոլեկուլային քաշը = հիմքերի քանակը × 324
Փորձարկվող նմուշի պատճենի համարը (պատճեններ/ուլ) = փորձարկվող նմուշի կոնցենտրացիան / նմուշի մոլեկուլային քաշը × 6 × 1014

Պատճենների համարի հաշվարկման եղանակը

Վերը նշվածը քանակի որոշման հաշվարկման եղանակն է։Սա մաթեմատիկական խնդիր է, որը կարելի է լուծել կրտսեր դպրոցն ավարտելուց հետո, իսկ մաթեմատիկական խնդիրները հիմնականում լուծվում են համակարգիչներով։Եթե ​​չես հասկանում, կարող ես գալ շփվելու։
հարաբերական քանակականացում
Հարաբերական քանակականացումը հիմնականում օգտագործվում է գիտական ​​հետազոտություններում։Քանի՞ վիրուս կա 1մլ արյան մեջ, և դա ԴՆԹ վիրուս է, սա համեմատաբար դետերմինիստական ​​իրադարձություն է. արյան քանակությունը կարելի է որոշել, իսկ ԴՆԹ վիրուսը համեմատաբար կայուն է։Այնուամենայնիվ, մեզ համար դժվար է համեմատել որոշակի գենի տառադարձման պատճենների թիվը տերևի մեջ, քանի որ դժվար է որոշել տերևի չափը, քաշը և քնքշությունը, դժվար է որոշել արդյունահանվող ՌՆԹ-ի քանակը, ինչպես նաև դժվար է որոշել հակադարձ տրանսկրիպցիայի արդյունավետությունը, այսինքն՝ որևէ քայլ կարող է թույլ տալ, որ փորձարարական տվյալները չունենան սխալներ:
Հետևաբար, հարաբերական քանակականացումը պետք է ներառի մի տարր.ներքին հղման գենը.
Այլ կերպ ասած, հարաբերական քանակականացումն իրականում համեմատություն է թիրախային գենի և ներքին հղումային գենի միջև:Նույն հյուսվածքի և նույն բջջի համեմատ, նմուշի չափի, ՌՆԹ-ի արդյունահանման քանակի, հակադարձ տառադարձման արդյունավետության և ՊՇՌ արդյունավետության ազդեցությունը համեմատաբար փոքր է:Նմուշի փոքր չափի պատճառով և՛ ներքին հղումային գեները, և՛ թիրախային գեները համեմատաբար կրճատվել են:Ահա թե ինչու մենք նախկինում շեշտում էինք միօրինակությունն ու կայունությունը։
Ներքին տեղեկատու գեները հիմնականումտնային տնտեսության գեներ(տնային գեներ), որոնք վերաբերում են գեների մի դասի, որոնք կայունորեն արտահայտված են բոլոր բջիջներում, և դրանց արտադրանքները անհրաժեշտ են բջիջների հիմնական կենսագործունեությունը պահպանելու համար:
Մի շփոթեք այս հասկացությունը:Տնային տնտեսության գեները կենսաբանական ֆունկցիայի տերմիններ են, մինչդեռ ներքին տեղեկատու գեները փորձարարական տեխնիկական տերմիններ են:Տնային տնտեսության գեները պետք է անցնեն վավերացում, նախքան դրանք կարող են ընտրվել որպես ներքին տեղեկատու գեներ:
Օրինակ, մենք ընտրեցինք մի քանի տնային գեներ ստորև նկարում, որպեսզի փորձարկենք դրանց արտահայտման մակարդակը տարբեր հյուսվածքային բջիջներում, և պարզեցինք, որ β-2-միկրոգլոբուլինի արտահայտման մակարդակները միանգամայն տարբեր են մյուս երեք գեների մակարդակներից, ուստի դրանք չեն կարող օգտագործվել որպես ներքին տեղեկատու գեներ:

Ներքին հղումային գենի շտկման գործառույթը հասկանալուց հետո երկու ալգորիթմ է ստացվում՝ շնորհիվ ներքին հղումային գենի ներդրման։
· կրկնակի ստանդարտ կորի մեթոդ
·2 – △△Ct մեթոդ (CT արժեքների համեմատության մեթոդ)
Եթե ​​դուք հետաքրքրված եք տեսակների և գեների գործառույթների ուսումնասիրությամբ, խնդրում ենք հրաժարվել ալգորիթմների հետազոտությունից և ուղղակիորեն օգտագործել բանաձևերը կամ ուղղակիորեն օգտագործել մեքենաները.եթե դուք ուղիղ տղա եք մաթեմատիկայի և ճարտարագիտության մեջ, խնդրում եմ ազատ զգալ:
կրկնակի ստանդարտ կորի մեթոդ
Ստանդարտ կորի միջոցով չափեք թիրախային գենը և տնային տնտեսության գենը և փորձարկվող նմուշը, այնուհետև հաշվարկեք հարաբերական արժեքը՝ ըստ հաշվարկման բանաձևի, որը արտահայտման հարաբերական մակարդակն է:
Առավելությունները՝ պարզ վերլուծություն, համեմատաբար պարզ փորձարարական օպտիմալացում
Թերություն. Յուրաքանչյուր գենի համար փորձերի յուրաքանչյուր փուլ պետք է կազմի ստանդարտ կոր
Կիրառում. գեների արտահայտման կարգավորման ուսումնասիրության երկու առավել հաճախ օգտագործվող և ճանաչված հարաբերական քանակական մեթոդներից մեկը
Բանաձևը հետևյալն է.

Օրինակները հետևյալն են.

Հաշվեք հարաբերական գումարը՝ ելնելով քանակական արդյունքից
2 – △△Ct մեթոդ (CT արժեքների համեմատության մեթոդ)

Առավելությունները. Կարիք չկա ստանդարտ կոր կազմել
Թերությունները. Ենթադրվում է, որ ուժեղացման արդյունավետությունը մոտ է 100%;ստանդարտ շեղումը < 5% է, և ստանդարտ կորը և արդյունավետությունը յուրաքանչյուր ուժեղացման միջև ենթադրվում է համահունչ.Փորձարարական պայմանների օպտիմալացումն ավելի բարդ է։
Կիրառում. գեների արտահայտման կարգավորման ուսումնասիրության երկու առավել հաճախ օգտագործվող և ճանաչված հարաբերական քանակական մեթոդներից մեկը

Իհարկե, ուժեղացման արդյունավետությունը սովորաբար անհնար է կատարելապես լինել 1. Ուղղման մեթոդ. Եթե մենք գիտենք, որ թիրախ գենը և հղումային գենը ունեն նույն ամպլիֆիկացման արդյունավետությունը, բայց ուժեղացման արդյունավետությունը հավասար չէ 1-ի, ապա 2-△△Ct-ը կարող է ուղղվել հետևյալ կերպ. , այնուհետև հաշվարկի բանաձևը կարող է ուղղվել մինչև 1,95-△△Ct
Առայժմ լյումինեսցենտային քանակական PCR-ի մասին բովանդակությունն ավարտվել է: